目 录
实验1 小液流法测植物组织的水势
实验2 气孔运动和钾离子的迁移
实验3 蒸腾强度的测定
实验4 植物的溶液培养和元素缺乏症
实验5 呼吸商的测定
实验6 过氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定
实验7 分光光度计法测定叶绿素a、b和类胡萝素的含量
实验8 离体叶绿体的光还原反应——Hill反应
实验9 小麦幼苗中蛋白质含量的测定
实验10 种子内蛋白酶活性的测定
实验11 植物组织中核酸含量的测定
实验12 核糖核酸酶（RNase）活性的测定
实验13 生长素和脱落酸的生物鉴定——小麦胚芽鞘直型生长试验
实验14 种子发芽率的快速测定
实验15 萌发小麦种子内α-淀粉酶活力的测定
实验16 植物发育过程中可溶性蛋白和过氧化物酶及酯酶同工酶的凝胶电泳分析
实验17 葡萄中可溶性糖含量的测定
实验18 番茄果实中果胶酶活性的测定
实验19 切花的延衰保鲜
实验20 干旱和盐度对植物体内游离脯氨酸积累的影响
实验1 小液流法测植物组织的水势
一、 原理
水势是水的化学势。植物体细胞之间以及植物细胞与外界环境之间水分的移动决定于细胞水势的大小，水总是从水势高的区域向水势低的区域移动。
当植物组织与外液接触时，如果其水势低于外液渗透势，则植物细胞吸水而使外液浓度变大；反之，植物组织失水而使外液浓度变小；若二者相等，则外液浓度不变，此时外部溶液的渗透势等于植物组织的水势。同一种溶液浓度不同，比重也不同。当两个不同浓度的溶液相遇时，稀溶液由于比重小而上浮；浓溶液比重大而下沉。当把浸过植物组织的溶液滴回到原来的溶液中时，会发生上浮、下沉或基本不动几种情况。如液滴不动，则表示溶液的渗透势等于该组织的水势。由此，植物组织的水势(ψw)= 溶液的渗透势(ψπ)= -icRT
二、 材料和设备
1. 植物材料：马铃薯块茎
2. 设备：试管；移液管；滴管；直径1cm打孔器；刀片
3. 试剂：1.00mol/ml蔗糖溶液；甲烯蓝
三、 实验步骤
1． 用1.00mol/L蔗糖溶液配制0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.70mol/L等一系列浓度递增的溶液，充分摇匀。分别取2ml溶液放入另一套编有相应编号的试管中。
2． 用打孔器在同一个马铃薯块茎上打取完整的马铃薯圆柱，并用干净的刀片将圆柱切成长1cm的小块（长度尽可能准确），共切出22块。切好后立即依次向装有2ml蔗糖溶液的试管中放入2块马铃薯切段（注意应使溶液液面浸过切段），盖上塞子或用滤纸将试管口封上后放置40min其间轻轻摇动试管几次。
3． 到时间后用长柄解剖针依放入薯块的次序将薯块取出。再用解剖针尖沾少许甲烯蓝粉末（不可多加）放入溶液，振荡试管，使甲烯蓝溶解，溶液成浅蓝色即可。
4． 用滴管吸取少量浸过马铃薯切段的溶液的试管中，滴管尖端达到溶液中部时，徐徐放入一滴蓝色溶液，轻轻抽出滴管，在试管背后放一张白纸，仔细观察蓝色小液滴移动的方向。
四、 结果
1、 记录实验结果，解释为什么小液滴会发生上浮、下沉、基本不动3种情况。
2、 根据公式计算马铃薯块茎细胞的水势。
ψ细=ψ外= -icRT 式中，ψ细为细胞水势（以MPa表示，0.1013255 Mpa =1atm,1 MPa=106Pa）；ψ外为外液渗透势；i为溶液的等渗系数；c为溶液浓度；T为绝对温度；R为气体常数，R=0.08205atm L/mol゜K。
五、思考题
1、 向浸过组织的溶液中加甲烯蓝时不能多加，为什么﹖
2、 此种测定植物组织水势的方法有何优缺点﹖
实验2 气孔运动和钾离子的迁移
一、原理
气孔是植物进行蒸腾作用和气体交换的通道和调节器，气孔的运动伴随着保卫细胞或副卫细胞内钾离子的迁移。在光下，钾离子流进保卫细胞或副卫细胞，细胞渗透势随之降低，细胞吸水，体积增大，使气孔张开；反之，在暗中上述过程逆转，于是气孔关闭。在光照条件下，保卫细胞中形成的蔗糖可能部分地被用作从周围细胞主动吸收钾的呼吸基质。
本实验用蚕豆下表皮为材料，用亚硝酸钴钠染色的方法观察在光、暗条件下保卫细胞中钾离子的变化。
钾离子与亚硝酸钴钠的反应式如下：
Na3Co(NO2)6+2K+ → K2Na[Co(NO2)6]+ 2Na+
为便于观察，进一步用5%硫化铵-5%甘油处理实验材料，硫化铵与K2Na[Co(NO2)6] 反应生成CoS黑色沉淀：2[Co(NO2)6]3-+3S2- → 2CoS↓+12NO2-+S
二、材料和设备
1．植物材料：蚕豆叶片；玉米叶片
2．设备：显微镜；镊子；剪刀；100W白炽灯
3．试剂：10%亚硝酸钴钠溶液，有两种配制方法：（1）称取10g亚硝酸钴钠配成10%的溶液，以10ml加一滴冰醋酸的量进行酸化，用时现配；（2）称取20g硝酸钴和35g亚硝酸钠，溶于75ml稀乙酸中（10ml冰醋酸+65ml蒸馏水）。溶解后，向溶液中通气，直至NO2完全放出（NO2特臭，有毒，22.4℃时凝结成红棕色液体，上述操作应在通风橱中进行）；5%硫化铵-5%甘油。
三、实验步骤
1. 实验前几天，给实验材料施少量钾肥，以免植物缺钾使实验结果不明显。
2．实验前一天将两盆蚕豆放进暗室，将其中一盆在实验前照光1-2h。
3. 从光、暗处理的蚕豆植株上分别摘取成熟叶片，用刀片在叶片下表皮划出5×5mm的小方格，再用尖头镊子撕下表皮；把表皮条放在冷冻的蒸馏水中冲洗2min，洗去外部的K+；然后放入冷冻的亚硝酸钴钠溶液中，15min后取出，用冷冻的蒸馏水洗3次，直至冲洗的水不发黄为止。
4．把冲洗后的表皮条再浸入硫化铵-甘油溶液中，室温下放置2min（最好在通风橱中进行），用蒸馏水洗去表皮条外部的沉淀和多余的硫化铵，在显微镜下观察保卫细胞内钾离子积累的情况。
四、结果
分别观察光、暗处理叶片的气孔保卫细胞，记述观察到的现象，并用简图表示气孔保卫细胞在光、暗处理下钾离子积累的情况。
五、思考题
1．气孔运动的机理是什么？
实验3 蒸腾强度的测定
一、原理
植物体以蒸汽状态不断向外界蒸散水分的过程叫植物的蒸腾作用。此过程受植物本身的调节和控制，同时受外界环境中温度、湿度、光照等条件的影响。
将带叶的枝条插入一定体积的水中，由于叶子不断进行蒸腾作用，可以通过水体积的减少来测定蒸腾强度。蒸腾强度是在一定时间内，单位叶面积散失的水量，常用g H2O/m2•h表示。
二、材料和设备
1．植物材料：棉花（Gossypium hirsutum）；丁香（Syringa oblata）
2．设备：标本筒；1ml移液管；100W台灯；吹风机；凡士林；小分液漏斗
三、实验步骤
1． 选取一枝生长健壮的棉花或丁香枝条，按图1所示安装好所需的测定装置。
2． 标本筒中装满水。在水中将枝条茎基部剪去一段，迅速插入橡皮塞孔中，在孔周围涂一层凡士林，以防漏气。盖紧橡皮塞，打开分液漏斗活塞，使标本筒和水平放置的移液管中都充满水，不能留有气泡。检查整个系统是否漏气、漏水，发现漏气、漏水处可用凡士林封好。最后关闭分液漏斗活塞。
3．枝条距光源约20cm处照光，保持叶面温度在25-28℃。当移液管内水柱的凹月面移动到刻度时，开始计时。每0.5h记录一次移液管中液面的位置，共记录两次。
4． 在距离枝条15cm处用吹风机吹风，记录叶表面温度，每0.5 h记录一次移液管中液面的位置，共记两次。
5． 在室内自然光线和无吹风的情况下按上述办法记两次读数，作为对照。
6． 实验结束后，将叶片剪下，计算叶面积。
四、结果
1． 叶面积的计算方法：剪下100cm2硫酸纸，称重。在此硫酸纸上画出并剪下叶片的实际形状，称重，叶面总面积S为：S=W1/W0×100 式中，W0为100cm2硫酸纸的重量；W1为按叶片形状剪下的硫酸纸的重量。
2． 计算蒸腾强度：Q=W/St 式中，Q为蒸腾强度，单位为g H2O/m2•h，W为由于蒸腾作用失去水的重量，（根据失水的体积换算成重量），S为叶面积，t为照光或吹风时间。
3．根据上式公式，分别计算在照光、吹风和对照条件下植物的蒸腾作用强度。
五、思考题
1、 实验用的枝条为什么要在水中剪下，不这样做会出现什么问题。
2、 比较不同条件下植物的蒸腾作用强度，说明蒸腾作用强度不同的原因。
实验4 植物的溶液培养和元素缺乏症
一、 原理
植物不断从外界环境中吸收它所需要的16种必要元素，其中C、H、O是从二氧化碳和水中得到的，其它的则主要通过根系吸收。根据需要量的大小，C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg、Fe被称为大量元素，而B、Cu、Zn、Mo、Mn、Cl被称为微量元素。当植物缺乏某种元素时即表现出一定的病症。
溶液培养法是研究植物对矿质元素需要的一种极好的方法，本实验用Knop溶液培养植物，并观察植物的矿质元素营养缺乏症。
二、材料和设备
1．植物材料：用沙培或在蛭石中培养的番茄幼苗（苗龄3-4周，最少有两片真叶）。在育苗期间应添加适量的自来水或1/2浓度的完全培养液。
2．设备：吸量管，量筒，玻璃棒，棉花，pH试纸，记号笔，培养缸
3．试剂：10%HCl溶液；10%NaOH溶液；10%Ca(NO3)2•4H2O 溶液；10% KNO3 溶液；2.5%KH2PO4 溶液；5%MgSO4•7H2O溶液；1%MgCl2溶液；10% KCl 溶液；5%CaSO4•2H2O溶液；10%NaNO3溶液；2.5%NaH2PO4•2H2O溶液；铁盐溶液（称取5g EDTA溶于约50ml蒸馏水中，加入FeSO4•7H2O 249mg，溶解并定容至100ml）
三、实验步骤
1、 培养液的配制：取16个培养缸彻底洗净，并用无离子水冲洗；每缸注入约2000 ml无离子水，按（表1）加入各种元素母液。然后加水至2400ml，搅匀，并用NaOH或HCL溶液调pH至6.0左右。每种营养配2份作重复。
表1 培养液的配制比例
营 养 液
母液 完全 缺N 缺P 缺K 缺S 缺Ca 缺Mg 缺Fe
Ca(NO3) 2 24 24 30 24 24 24
CaSO4 48 6
KNO3 6 6 6 6 6 6
NaNO3 6
KH2PO4 24 24 24 24 24 24
NaH2PO4 24
MgSO4 12 12 12 12 12 12
MgCl2 12
KCl 溶液 3 9 6 3 3 3 3
铁盐溶液 5 5 5 5 5 5 5
H2O 2331 2307 2352 2328 2331 2355 2337 2336
2、 移植幼苗：选取49棵生长一致的健壮幼苗，小心地用自来水冲洗一遍。用少许棉花裹住茎基部，固定在瓷缸的孔中，每缸三棵。留有一孔作通气用，可松松地盖以棉花防止尘土落入。苗根部要浸在营养液中，但勿使棉花沾湿。移栽以后，将培养物放在温室内阳光充足处，并争取昼夜有一定温差。
3、 培养物的管理与观察：每天早晚两次用玻璃棒搅动溶液，使溶液中保持足够的气体含量；必要时补一些无离子水，使溶液维持在实验开始的量；每周测pH两次，必要时可调整pH，使其维持在起始值；每周更换一次培养液，以保证营养条件的平衡；每天观察植物的生长情况，每周作1-2次记录，特别应注意营养缺乏症的现象及出现日期。连续观察4-6周后结束实验。
四、结果
1．在培养开始时，取剩余的一棵幼苗记录其株高、叶数、叶色、茎色、根数、根长、根色；
2．记录观察结果
五、思考题
1、试讨论分析实验中观察到的现象。
实验5 呼吸商的测定
一、 原理
呼吸商（Respiratory quotient简称R.Q.）又称呼吸系数。其定义是呼吸过程中释放CO2和吸收O2的体积之比。因此，同时测定植物组织呼吸过程中所释放CO2的体积和吸收O2的体积，便可求出其呼吸商。
二、 材料和设备
1、 植物材料：将小麦和大豆种子于室温下用水浸泡12h，转入铺有纱布并用水湿润的瓷盘中，于20℃培养箱内萌发48h。
2、 设备：呼吸瓶；0.5ml吸量管；乳胶管；滴定管支架；升降架；100ml烧杯
3、 试剂：40%NaOH溶液；0.1%甲稀兰溶液；液体石蜡
三、实验步骤
1． 按图2的装置安装仪器。取一支0.5ml的吸量管，用滴定管支架垂直固定，调节吸量管使其下端插入小烧杯内的甲稀兰溶液中。
2． 称取10g萌发48h的小麦种子铺于呼吸瓶的底部。向呼吸瓶的碱槽内注入10ml 40%NaOH，并加入1ml液体石蜡于NaOH表面。瓶口塞上带有温度计和弯管的橡皮塞，用乳胶管将弯管和吸量管连接，立即记下吸量管内液体表面的高度A1和反应开始的时间。
3． 1h后，记下液面的位置A2；然后，倾斜玻璃瓶，使NaOH从碱糟中流出，以停止种子呼吸并吸收瓶内CO2，此时，吸量管内的液面表面迅速上升，带液体表面停止上升时，记录液面的位置A3。
4． 按照上面的操作测定大豆种子的呼吸商。
四、结果
计算A2-A1及A3-A1的体积，并分别用VA和VB代表。种子在呼吸过程中吸收O2，放出CO2，所以VA就是吸收O2和放出CO2体积之差。当NaOH从碱糟中流出后CO2被NaOH迅速吸收，种子呼吸停止，所以VB为种子呼吸过程中吸收O2的体积，VB-VA即为放出CO2的体积。因而，呼吸商可用下式计算：R.Q.=（VB-VA）/VB
比较小麦和大豆种子呼吸商的差异，并说明其原因。
五、思考题
1、 若某一呼吸基质的R.Q.< 1，实验中A2的高度是高于还是低于A1，为什么？
2、 若在呼吸过程中，有机酸C4H6O6和脂肪酸C18H34O2完全氧化成CO2和水，试写出反应方程式并求出呼吸商。
实验6 过氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定
一、原理
过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其它分子缩合，产生颜色较深的化合物。多酚氧化酶则催化分子态氧将酚类化合物氧化成醌类的反应。本实验以愈创木酚为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在470nm有最大光吸收，故可通过测470nm下的吸光度变化以测定过氧化物酶的活性。本实验又以儿茶酚为多酚氧化酶的底物，其氧化产物在525nm下有最大光吸收。
二、材料和设备
1．植物材料：马铃薯块茎。 2．设备：分光光度计；离心机；研钵；25ml容量瓶；量筒；试管；吸量管。 3．试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液(pH5.5)；0.05mol/L愈创木酚溶液；0.1mol/L儿茶酚溶液；2% H2O2；20%三氯乙酸溶液。
三、实验步骤
1． 酶液的制备：取5.0 g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量磷酸缓冲液研磨成匀浆，3000×g离心10min，上清液转入25ml容量瓶中。沉淀用5ml磷酸缓冲液再提取2次，合并上清液，定容至刻度，低温下保存备用。
2．过氧化物酶活性的测定：酶活测定的反应体系包括2.9ml 0.05mol/L磷酸缓冲液、1.0ml 2% H2O2、1.0ml 0.05mol/L愈创木酚和0.1ml酶液。用在沸水中加热5min的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min。然后迅速转入冰浴中，并加入2.0ml 20%三氯乙酸终止反应。然后，过滤（或5000×g离心10min），适当稀释，470mn波长下比色。
3．多酚氧化酶活性的测定：配制酶的反应体系包括3.9ml磷酸缓冲液、1ml儿茶酚和0.1ml酶液。以煮过失活的酶液为对照，做二组重复实验。反应体系加入酶液后，37℃保温10min，迅速放入冰浴中，立即加入2ml三氯乙酸，5000×g离心10min ，收集上清液，并适当稀释，于525nm波长下比色。
四、结果
以每分钟内A470和A525变化0.01分别为1个过氧化物酶活力单位和1个多酚氧化酶活力单位，计算马铃薯两种酶的活力及比活力。
酶活力（0.01ΔA/min）=ΔA /0.01t×D
酶比活（0.01ΔA /g鲜重•min）=ΔA /0.01Wt×D
式中，ΔA为反应时间内吸收光度的变化；W为马铃薯鲜重（g）；t为反应时间（min）；D为稀释倍数，即提取的总酶液为反应系统内酶液的倍数。
五、思考题
1、 若有活性已知的辣根过氧化物酶，设计一个实验，以辣根过氧化物酶为标准制作标准曲线，测定某植物中过氧化物酶的活力。
2、 酶活力的单位可用g（鲜重）、g（干重）及mg（蛋白）3种方式来表示，哪种表示更好一些；为什么?
实验7 分光光度计法测定叶绿素a、b
和类胡萝素的含量
一、 原理
叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光波长范围内的最大吸收峰分别位于663nm和645nm处，同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数是已知的，根据Lambert-Beer定律可得出叶绿素a、b的浓度与它们在645nm和663nm处的吸光度（A）之间的关系式如下：
CA=12.7A663-2.69A645
CB=22.9A645-4.68A663
CA+B=20.2A645+8.02A663
式中，CA、CB、CA+B分别为叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b的浓度。
丙酮提取液中类胡萝素的浓度可按下式计算：Ck= 4.7A440-0.27 CA+B
二、材料和设备
1、 植物材料：菠菜叶子
2、 设备：剪刀；台秤；研钵；移液管；漏斗；分光光度计。
3、 试剂：丙酮；CaCO3（固体）。
三、实验步骤
1、 提取叶绿素：从菠菜植株上选取有代表性的叶片，洗净擦干，去叶柄及中脉剪碎混匀后，称取0.5g片置研钵中，加入2ml丙酮和少许CaCO3研磨，再加入5ml 80%丙酮，研磨成匀浆，将匀浆用80%丙酮定容至10ml，摇匀后，马上吸取2 ml置于试管中，再加入80%丙酮（加入的体积可根据色素提取液的颜色深浅来决定）进一步提取。静止或离心后，用滴管吸出上清夜，供测定用。
2． 测定吸光度：将上述色素提取液放入1cm光程的比色杯中，用80%丙酮为对照，分别测定440nm、663nm、645nm处的吸光度值。
四、结果
1．将测得叶绿素的吸光度值分别代入公式，计算出色素提取液中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b及类胡萝卜素的浓度。再根据稀释倍数分别计算出每g鲜重叶片中所含叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a+b及类胡萝卜素的含量。
2．根据计算出的CA和CB，分别求出菠菜的CA/CB。
五、思考题
1、比较阳生植物和阴生植物的CA/CB ，说明为什么不同?
2、叶绿素a和b在可见光的蓝光区和红光区都有一最大吸收峰，在进行定量测定时为什么用红区吸收峰的吸收值而不用蓝区吸收峰的吸收值?
实验8 离体叶绿体的光还原反应——Hill反应
一、 原理
叶绿体是植物进行光合作用的器官。从绿色植物叶片中提取出的叶绿体，当悬浮在适当的反应介质中，并有氧化剂（如2，6-二氯酚靛酚，简称2，6-D或DCPIP）存在时，在光照下会放出氧气，同时将氧化剂还原，这就是叶绿体中进行的光还原反应。2，6-D被还原后，颜色从蓝色变为无色，因此，可根据溶液吸光度的变化来测定叶绿体的光还原反应。
二、材料和设备
植物材料：菠菜叶片。设备：研钵；纱布；试管；100W灯泡；分光光度计。试剂：80%丙酮；提取介质——50mmol/L Tris-Cl(pH7.5)缓冲溶液，内含0.4mol/L蔗糖、10mol/L NaCl；1mmol/L 2，6-D溶液，用上述提取介质配制。
三、实验步骤
1、 离体叶绿体的提取：将新鲜菠菜叶片洗净擦干，去中脉，称取10g叶片，剪碎后放入研钵中（研钵置于冰浴里），加入10ml预冷的提取介质（可分两次加入），迅速将叶研磨成匀浆，再加入10ml提取介质继续研磨。匀浆通过4层纱布过滤于一离心管，4℃下700×ɡ离心3min，弃沉淀。将上清夜于4℃ 1500×ɡ离心7-8min，弃上清夜，沉淀即为完整叶绿体。用提取介质悬浮叶绿体，适当稀释使其在660nm处的吸光度值达1.0左右，置冰浴中备用。
2、 叶绿体光还原反应的测定: 取3支试管编上号，将2号试管包上锡纸或黑纸塑料布；在3支试管中各加入4.5ml提取介质及0.5ml叶绿体悬浮液；将3号试管放沸水浴中煮沸15min，取出冷却至室温；分别向3支试管中各加入5ml 2,6-D溶液，摇匀，立即用提取介质为空白，测620nm处的吸光度值，作为零时的读数。
将三支试管于玻璃方缸内的试管架上，缸内装20℃水。如无玻璃方缸，也可用800-1000ml大烧杯代替：将台灯放在距缸30cm处，照光5min，关灯；摇匀，立即比色，按上述零时测定；测完毕将溶液分别倒回原试管，按上述重复测6次。
3、 叶绿素含量的测定：取0.1ml上述叶绿体悬浮液，用80%丙酮定容至10ml，摇匀后于3000×ɡ离心5 min，以80%丙酮为空白测上清液于652nm处的吸光度值，按下面公式计算叶绿体悬浮液的叶绿素含量。
C（mg/ml）=A652N/34.5 式中，N为稀释倍数。
4、 绘制标准曲线：用提取介质将1mmol/L 2,6-D溶液稀释成浓度分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8mmol/L的溶液各10ml（每种浓度各做一重复），摇匀后测620nm处的吸光度值。以2,6-D浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。
四、结果
1. 以2号管的吸光度值减去1号管的吸光度值，在标准曲线上查出对应于各ΔA的2,6-D的含量，并计算出希尔反应活力（μmol 2,6-D/mɡ(叶绿素)•h。
2. 以希尔反应速度为纵坐标，照光时间为横坐标，将实验结果绘成曲线。
五、思考题
1. 什么是希尔反应，希尔反应的发现在光合作用的研究有何意义？
实验9 小麦幼苗中蛋白质含量的测定
一、 原理
目前常用的蛋白质测定方法有定氮法、双缩脲法、Folin-酚法、考马斯亮蓝法、氨基酸分析法和紫外吸收法等方法。本实验选择Folin-酚法和紫外吸收法测定小麦幼苗中可溶性蛋白质的含量。前者灵敏度高、微量的特点，后者简便、快速、兼有较高灵敏度的优越性。
Folin-酚法又名Lowry法，Folin-酚试剂由Ⅰ、Ⅱ两部分组成：试剂Ⅰ相当于双缩脲试剂，其中的碱性铜试剂与蛋白质产生双脲反应，形成紫色络合物；试剂Ⅱ含磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下，二者能被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸还原成钨蓝和钼蓝。由于Folin-酚试剂与蛋白质作用具有两种呈色反应，故反应的灵敏度高。但酚类物质和柠檬酸对此法有干扰作用。
紫外吸收法测蛋白质含量的原理是由于蛋白质分子的组成中通常含有酪氨酸和色氨酸，这两种氨基酸残基的苯环含有共轭双键，在280nm处有吸收峰，其吸光度和蛋白质的含量呈线性关系，故可用作蛋白质的含量测定。紫外吸收法简便、快速、灵敏、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的分离提取中常用此法进行检测，如在层析中用来检测蛋白质吸附和洗脱的情况。该方法的不足是容易受蛋白质种类(酪氨酸、色氨酸含量的差异)、核酸、嘌呤、嘧啶及衍生物干扰。对于前者干扰，可选择与被测定蛋白质组成相似的蛋白质做标准曲线加以校正；对于后者的干扰，可利用它们吸光度的差异，通过计算加以校正。
表2 紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子
A280 /A260 核酸% F A280 /A260 核酸% F
1.75 0.00 1.116 0.846 5.50 0.656
1.63 0.25 1.081 0.822 6.00 0.632
1.52 0.50 1.054 0.804 6.50 0.607
1.40 0.75 1.023 0.784 7.00 0.585
1.36 1.00 0.994 0.767 7.50 0.565
1.30 1.25 0.970 0.753 8.00 0.545
1.25 1.50 0.944 0.730 9.00 0.508
1.16 2.00 0.899 0.705 10.00 0.478
1.09 2.50 0.852 0.671 12.00 0.422
1.03 3.00 0.814 0.644 14.00 0.377
0.979 3.50 0.776 0.615 17.00 0.322
0.939 4.00 0.743 0.595 20.00 0.278
0.874 5.00 0.682
含核酸较少的蛋白质样品，可根据其吸光度A280和A260的大小，由经验公式算出样品中蛋白质的浓度。 蛋白质的浓度(mɡ/ml)=1.55A280-0.76A260；对于含核酸较多的蛋白质样品，可利用Warburg和Chritstian的校正表（表2）和公式计算出蛋白质的浓度。 蛋白质的浓度（mg/ml）=F×A280/d 式中和表中，A280和A260分别为蛋白质样品对280nm和260nm的吸光度值；F为校正因子；d比色杯的厚度(cm)。
二、材料和设备
植物材料：萌发一周的小麦幼苗。设备：紫外分光光度计；离心机；吸量管；试管；容量瓶；量筒；恒温水浴；剪刀。试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）；250µg/ml牛血清蛋白标准溶液。
Folin-酚试剂：（1）试剂I—1g Na2CO3溶于50ml 0.1mol/L NaOH溶液中；另将0.5g CuSO4•5H2O溶于100ml1%酒石酸钾/钠溶液中。将前后两种溶液按50：1混合，即为试剂I，且只能使用一天。（2）试剂II—将100g Na2WO4•2H2O、25g Na2MoO4•2H2O、700ml蒸馏水、50ml 85%磷酸及100ml浓盐酸装入2000ml圆底瓶中，文火缓慢回馏10h；再加150g Li2SO4、50ml蒸馏水及数滴溴液；将烧瓶内液开口煮沸15min，除过量的溴；冷至室温后定容到1000ml,过滤，滤液呈微绿色。吸取10ml 1mol/L NaOH，加入2滴酚酞指示剂，用上述滤液滴定；当溶液颜色由微绿经紫红、紫灰，到墨绿色时即为滴定终点。根据其酸度将滤液稀释为1mol/L的氢离子浓度，此液即为Folin-酚试剂II。将其置于棕色试剂内，可用冰箱长期保存备用。
三、实验步骤
1、 蛋白的提取: 取2g小麦幼苗，剪碎，放入研钵中，加10ml磷酸缓冲液，充分匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，5000×g离心10min，将上清液转入25ml容量瓶中。用5ml磷酸缓冲液悬浮沉淀，同上述操作，再提取2次，上清液并入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度。
2、 Folin-酚法测定蛋白质含量
（1）标准曲线的制定：取12支试管分成两组，分别加入250ug/ml的标准蛋白溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，补水至1ml，另取1支试管，加蒸馏水1ml作对照。向每支试管中加入5ml试剂I，混匀，25 ℃室温下放置10min；再加入0.5ml试剂II，混匀，25℃下放置30min，然后于500nm处测标准液的吸光度。以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）样品的测定：取0.2ml蛋白质提取液，加0.8ml水，按测定标准曲线的方法测定吸光度。
3、 紫外吸收法测定蛋白质的含量：取1ml蛋白质提取液，适当稀释后，用1cm厚的比色杯测其在280nm和260nm处的吸光度。
四、结果
1、 根据Folin-酚法测定样品的A500数值，从标准曲线上查出样品中蛋白质的浓度，计算每g鲜重小麦幼苗含蛋白质的mg数。
2、 根据用紫外吸收法测定样品所得到的A280和A260的值，由经验公式直接算出样品测定液中蛋白质的浓度，并换算出小麦中的蛋白质含量（mg蛋白/g FW）。
3、 比较用两种方法所测得数据的差异，分析其产生的原因。
五、思考题
1、 Folin-酚法和紫外吸收法测蛋白质含量的原理是什么？各有哪些优缺点？
2、 样品中若含有核酸类杂质，用紫外吸收法测定样品中蛋白质的含量，如何校正测定值？怎样确定样品中是否含有核酸类物质？
实验10 种子内蛋白酶活性的测定
一、 原理
蛋白酶能催化蛋白质水解成氨基酸。酶活力可用所生成氨基酸的量来表示，氨基酸生成的量则可用甲醛滴定法测定。氨基酸为两性离子，其氨基酸的pK值一般在9以上，若用NaOH滴定，不能用一般酸碱指示剂指示滴定终点;但甲醛可与氨基酸中的氨基作用，形成羟甲基氨基酸，使pK值下降，滴定终点移至pH9左右，这正好是酚酞指示剂的变色范围，因此可用酚酞作指示剂，用NaOH滴定-NH3+上的H+，这种方法称为甲醛滴定。有关反应如下：
R-CH-COO- ─→ R-CH-COO- + H+
│ │
NH3+ NH2
R-CH-COO- +2HCHO ─→ R-CH-COO-
│ │
NH2 N(CH2OH)2
H+ + NaOH ─→ H2O + Na+
随着酶解反应的进行，水解液中氨基酸含量增加，当滴定值恒定或不再明显增加时，即表示水解已完成或酶已失活。
二、材料和设备
1、 植物材料：取5g风干的黄豆，浸泡过夜，放入铺有滤纸的湿润培养皿内，20℃下萌发3-5天。
2、 设备：研钵；100ml容量瓶；恒温水浴；吸量管；50ml锥形瓶；滴定管。
3、 试剂：0.02mol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.5)；0.5%蛋白胨溶液，用上述缓冲液配制；0.5%酚酞酒精（60%）溶液。
中性甲醛溶液---50ml 36%-37%甲醛，加1ml 0.5%酚酞溶液，临用前用0.1mol/ml NaOH滴定至微红色。
0.1mol/L NaOH溶液——称4g NaOH，溶于500ml经煮沸并冷却的蒸馏水中，装入试剂瓶内，用橡皮塞将瓶口塞好，经标定后稀释为 0.1mol/L NaOH溶液。NaOH的标定——准确称取105℃下恒重的草酸（H2C2O4•2H2O）1.575g，溶于煮沸过冷却的蒸馏水中，再全部转入250ml容量瓶内，稀释到刻度，摇匀，计算其摩尔浓度；吸取此草酸溶液2份，每份10ml分别置于50ml锥形瓶中，各加2滴酚酞溶液，用上述NaOH溶液滴定至微红色。由消耗的NaOH体积计算其摩尔浓度。
草酸的摩尔浓度=(1.575/126.07)÷0.25L=0.05mol/L
H2C2O4 + 2NaOH = Na2C2O4 + 2H2O
三、实验步骤
1、 蛋白质的提取：将5g萌发5天的黄豆种子，去皮，放在研钵中，加入适量磷酸缓冲液，匀浆，将匀浆液定容到50ml，摇匀，8000×g离心15min，取上清液作为蛋白酶粗酶液。
2、 酶的水解反应：取50ml锥形瓶4个，每瓶中加入5ml粗酶液和5ml磷酸缓冲液。用其中两瓶置于沸水浴中加热5min，使酶失活作为对照；然后向每个锥形瓶内加入5ml蛋白胨和1ml甲苯溶液，塞上瓶口，于37℃恒温条件下放置12-14h。保温结束后，将两个样品瓶置沸水浴中加热5min。
3、 氨基酸的滴定：向每个锥形瓶内加入3滴酚酞溶液，摇匀，用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色；然后向每瓶内加入5ml中性甲醛溶液，摇匀，再用0.1mol/L NaOH溶液滴定至微红色。记录第二次滴定所消耗的NaOH溶液量。样品和对照的耗碱量分别用VA和V0表示。
四、结果
1．计算每个处理氨基氮的含量。
氨基氮含量（mg/g鲜重）= [(VA - V0)×1.4008×D]/W（g）
2．计算萌发3天的大豆种子内蛋白酶的比活力。以每产生1mg氨基氮为1个活力单位。
酶的比活（mg氨基氮/g.h）= [(VA - V0)×1.4008×D]/[W(g)t(h)]
式中，V0为滴定对照瓶消耗的0.1mol/L NaOH溶液的平均ml数；VA为滴定样品瓶消耗的0.1mol/L NaOH溶液平均数；1.4008为消耗1ml 0.1mol/L NaOH溶液相当的氨基氮的mg数；D为样品稀释倍数，即酶提取液ml数/反应液中的酶液ml数；W为样品重量（g）；t为反应时间（h）。
五、思考题
1、甲醛滴定法中，NaOH溶液滴定的是氨基酸中的羧基还是氨基，为什么?
2、在加入甲醛试剂前，为什么先用NaOH溶液将待测液调酚酞指示剂显微红色?
3、甲醛滴定法有何优缺点?
4、配制和标定NaOH溶液应注意什么?
实验11 植物组织中核酸含量的测定
一、 原理
核酸的基本单位是核苷酸，核苷酸是由磷酸、戊糖和碱基所组成。因而所有测定核酸的方法都是根据：（1）磷的测定；（2）核糖或脱氧核糖的测定；（3）嘌呤或嘧啶的测定设计的。本实验先用两种方法测定核酸：（1）紫外（UV）吸收光度法，以核酸的碱基在260nm波长下具有特征性的吸收峰为根据；（2）二苯胺法，其原理是DNA中的脱氧核糖在酸性条件下脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，该产物和二苯胺作用生成蓝色物质，对600nm光波有最大吸收。当核酸含量在40-400ug/ml范围内，它的反应产物的吸光度A600与其含量成正比。这个反应专一性强，仅有脱氧木糖和阿拉伯糖对其稍有干扰。
植物组织除含核酸外，还含有游离态的核苷酸类化合物。它们会干扰核酸的测定，因此在测定核酸前必须对植物材料进行预处理，排除干扰。然后将RNA或DNA（常以核苷酸的形式）抽提出来，通过紫外吸收法、定糖或定磷等方法进行定量测定。本实验用紫外吸收法测定核酸的总量，用二苯胺法测定DNA的含量，并通过计算求出RNA含量。
二、材料和设备
1．植物材料：萌发5天的小麦幼苗。
2．设备：玻璃匀浆器；冷冻离心机；恒温水浴；紫外分光光度计。
3．试剂：甲醇；乙醇；乙醚；2%和4% KOH；0.2mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L HClO4。
DNA标准溶液——称取5.0mg小牛胸腺DNA钠盐，用蒸馏水溶解，定容到25ml，配成200ug/ml DNA贮液；
二苯胺试剂——称取分析纯二苯胺（若发黄须用70%乙醇重结晶）1.0g溶于100ml冰醋酸中，加入10ml 60%过氯酸，摇匀后贮藏于棕色试剂瓶中，暗处保存。使用前每10ml二苯胺试剂加入0.1ml 1.6%的乙醛溶液。
0.6%乙醛溶液——2ml 40%乙醛加48ml水。
三、实验步骤
1、样品的预处理
取5天龄的小麦幼苗，剪碎。称取2份0.50g样品，放入玻璃匀浆器内，加入2ml甲醇，于冰浴中匀浆；将匀浆液转入10ml离心管中，并用2ml甲醇洗匀浆器两次，洗液并入管中；于5000×g下离心10-15min，弃上清液；然后用4ml 0.2 mol/L冷HClO4悬浮离心两次，以除去酸溶性物质；再用4ml冷乙醇抽提沉淀两次，弃上清液，除去醇溶性物质；再加入5ml乙醇-乙醚混合液（2:1，v/v），于50℃下保温30min，4000×g下离心10min，弃上清液，以除去酯类物质。至此，沉淀中主要含有核酸、蛋白质和纤维素类物质。
2、核酸的水解和水解产物的提取
用5ml 0.5 mol/L HClO4悬浮离心管中预处理过的沉淀物，置于75℃恒温水浴中保温30min；然后用1mol/L KOH中和到中性，定容到10ml，4000×g离心10min，收集上清液有用于核酸的测定。
3、总核酸含量的测定
用紫外分光光度计于波长260nm和290nm处测核酸水解液提取物的吸光度，计算核酸的含量。
核酸的含量（μg/ml）=57×（A260-A290）
4、DNA含量的测定
(1)、标准曲线的测定：取10支试管分成两组，依次编号，并加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0ml DNA标准溶液，然后向每个试管内补蒸馏水到2ml；另取1支试管，加2ml蒸馏水作对照。向每支试管内加入4ml二苯胺试剂，混匀，置于60℃水浴中保温1h；保温后，冷却，以对照液作空白，于595nm下测定吸收度值；以DNA的浓度为横坐标，以平均吸光度度值为纵坐标绘制标准曲线。
（2）样品DNA含量的测定：按照测定标准曲线的方法测定样品提取液与二苯胺试剂反应后的吸收度值，从标准曲线上查出相应的DNA浓度，计算出DNA含量。
植物组织中核酸测定的图解如下：
0.50g小麦幼苗，于2ml甲醇中匀浆，用2ml冷甲醇洗匀浆器两次
RNA = 总核酸量 - DNA
四、结果
1、 根据公式和DNA测定标准曲线，计算小麦幼苗中核酸和DNA的含量（鲜重）。
2、 求出小麦幼苗中RNA的含量。
五、思考题
1、 实验中哪些操作要求在低温下进行，为什么？
2、 紫外吸收测定核酸和二苯胺法测定DNA各有什么优缺点？
3、 测定植物体内的核酸含量有何生理意义？
实验12 核糖核酸酶（RNase）活性的测定
一、 原理
核糖核酸酶是将核糖核酸水解成单磷酸核苷或寡核苷酸的一类酶。本实验是用RNase的粗提液与底物RNA作用一定时间后，用RNA沉淀剂,即过氯酸-醋酸双氧铀（或过氯酸-钼酸铵）将未降解的RNA沉淀，通过测定降解物提取液中核苷酸类物质生成的量来测定RNase活性。
植物中RNase的种类多、耐热、活性高，是一种较容易测定的酶。本实验用玉米幼根的一系列切断为材料，来研究RNase的相应活性与根的发育程度的关系。
二、材料与设备
1、 植物材料；苗龄3-4天的玉米幼苗； 2. 设备：小型玻璃匀浆器；冰冻离心机；紫外分光光度计；10ml刻度具塞试管；塑料尺；剪刀；镊子。 3. 试剂：0.2mol/L HClO4-0.5×10-2mol/L醋酸双氧铀稀释液；提取介质(0.01mol/L磷酸缓冲液(pH6.5))；反应介质(含0.5mol/L蔗糖、1mmol/L MgSO4、10mmol/L KCl及2mg/ml的酵母RNA)；过氯酸-醋酸双氧铀溶液(含1mol/L HClO4-0.5×10-2mol/L醋酸铀（醋酸双氧铀可用2.5×10-2mol/L钼酸铵代替）)。
三、实验步骤
1、 核糖核酸酶液的提取：将萌发3-4天的玉米幼苗初生根从根尖向基部切成1、2、3三段，各段长分别为0.5、1.0、2cm，每段重1g，于玻璃匀浆器中，加5ml 0.01mol/L磷酸缓冲液，于冰浴中匀浆。然后于0℃下5000×g离心10min，取上清夜即为RNase粗酶液。
2、 RNase的水解反应：每样取4支10ml具塞试管，向每管内加1ml酶液和1ml反应介质；将1、2两支试管于冰浴中（对照），3、4两支试管于30℃恒温水浴中保温30min，此间摇动数次；保温结束后，将3、4号试管也转入冰浴中，立即向每试管中加入0.5ml预冷的高氯酸-醋酸双氧铀沉淀剂，摇动，静止10min，于5000×g离心10min，上清液转入10ml刻度试管中，定容到10ml。
3、 水解产物的测定：以1份提取介质、1份反应介质和0.5份醋酸双氧铀溶液的混合液作空白，测反应液在260nm和290nm处的吸光度，由公式计算反应液中RNA水解产物的浓度。RNA浓度（μg/ml）=（ΔA260-ΔA290）×57，ΔA260和ΔA290分别为管3、4和管1、2在260nm和290nm处平均吸光度之差。
四、结果
1、 计算每个样品中RNA水解产物的平均含量。
2、 以每g鲜重植物材料，30min内水解1ug RNA为一个RNase活性单位，计算每个样品内的RNase的活性。
3、 比较玉米根的不同切段RNase的活性，并进行分析。
五、思考题
1、 根据本实验的原理，设计一个测定DNase活性的实验方案。
2、 测定植物体内RNase活性有何生理意义?
3、 实验材料的1、2、3切段，各属于什么组织? 在发育程度上有何差异?
实验13 生长素和脱落酸的生物鉴定
——小麦胚芽鞘直型生长试验
一、原理
生长素对植物生长的作用具有两重性：在低浓度下，通过细胞延长可以促进植物的生长；中等浓度可以抑制生长；过高浓度则导致植物死亡。脱落酸则除了对植物休眠和脱落有作用外，并能抑制植物的生长。
黄化燕麦胚芽鞘发育初期，即不到1cm长时，有细胞分裂，但超过1cm长就没有细胞分裂，生长只依靠细胞的延长。在研究没有细胞分裂而只有细胞延长时，胚芽鞘可以被认为是一个极好的材料。去除胚芽鞘顶端（约4cm），生长就会停止；外加生长素能使切去顶端的胚芽鞘继续生长。脱落酸的作用则正好相反。因此，将切下的胚芽鞘伸长部分，放进含有实验物质的溶液中，测定一定时间内它的生长度，用对照作比较，可证明生长素和脱落酸的存在及浓度范围。小麦种子来源比燕麦广，其试验效果与燕麦类似。本实验采用直型生长试验观察小麦胚芽鞘切段的生长。
二、材料和设备
1．植物材料：萌发3-4天的黄化小麦苗，高约3cm。
2. 设备：镊子；切段器；吸量管（1ml、5ml）；具塞刻度试管；青霉素小瓶；具刻槽的有机玻璃板；摇床或振荡器。
3. 试剂：pH5.0含糖磷酸缓冲液——称取1.794g K2HPO4、1.019g柠檬酸、20g蔗糖，用水溶解并在容量瓶中定容至1000ml，其pH为5.0。
100mg/ml顺式脱落酸（IAA）母液——称取10mg IAA，用少许无水乙醇溶解后，用水稀释并在容量瓶中定容至100ml。（化学合成的ABA药品是顺式和反式各占一半，但只有顺式的有生理活性。）
三、实验步骤
1. IAA的测定
(1) 挑选生长整齐的60株黄化小麦苗，10株为一组，共6组，其中一组用作对照；用切段器从苗的尖端8mm处将其切成3mm和5mm两个切段，尖端的3mm切段弃去，留用后面的5mm切段，泡在蒸馏水中1h，以除去切段中的内源激素。
(2) 配制IAA系列标准溶液（配在具塞刻度试管中）：10、1.0、0.1、0.01、0.001mg/L IAA。用吸量管吸取上述5中浓度的IAA溶液各5ml，分别注于5组（一组10个）青霉素小瓶中，另做一组（10个）对照瓶用缓冲液代替IAA溶液。
(3) 用镊子取出在蒸馏水中浸泡1h的切段，用滤纸将其表面水分吸干，分别放入具有各种浓度的IAA的小瓶中；23℃黑暗振荡培养，24h后取出，用具刻槽的有机玻璃板测量其长度。
2. ABA的测定
配制0.001-10mg/L ABA系列标准溶液，其余操作与IAA测定方法相同。
四、结果
1、 将各瓶内的切段取出，用滤纸将其表面溶液吸干，首尾相接地整齐排列在有机玻璃板的刻槽中，量出每组的10个切段的总长度，列表记录。
2、 计算IAA处理中平均增长的百分数（%）
（处理长度-对照长度/原来长度）×100%
3、 计算ABA处理比对照组生长减少的百分数（%）
（处理长度-对照长度/原来长度）×100%
4、 在半对数坐标纸上，将IAA浓度（对数）作横坐标，以各处理的平均增长的百分数（%）为纵坐标作图，得胚芽鞘生长减少与IAA浓度关系的曲线。
5、 在半对数坐标纸上，将ABA（顺式）浓度（对数）作横坐标，以比对照组生长减少的百分数（%）为纵坐标作图，得胚芽鞘生长减少与ABA浓度关系的曲线。
五、思考题
1、 本试法为什么要选用距芽鞘顶端3mm的切段为试材?
2、 如果要测定某一植物提取液中的IAA含量时，实验应如何设计? 如果要测定ABA又该如何设计?
实验14 种子发芽率的快速测定
一、原理
种子发芽率是指在最适宜条件下，在规定天数内，发芽的种子数占供试种子数的百分率。也就是说，种子发芽率是在特定条件下的种子活力，它是决定种子品质和实用价值的重要依据。
用直接发芽的方法测定发芽率所需时间较长，而快速测定法则能在较短时内获得结果。其测定结果与发芽的方法比较，在许多种子中，虽然不完全相同，但趋势大体一致。
二、材料和设备
1．植物材料：经吸涨的小麦种子；经吸涨的萝卜种子。
2．设备：100ml烧杯；直径9cm培养皿；刀片；镊子；小玻棒；白瓷板；天平；煤气灯；恒温箱；紫外荧光灯；100ml容量瓶。
3．试剂：5%红墨水；琼脂。
0.1%溴麝香草酚蓝（BTB）溶液——称取0.1g BTB，溶于水中，定容至100ml，用滤纸滤去残渣。本指示剂应处于微碱性范围中，若溶液呈黄色，可加入数滴稀氨水，使之呈蓝色或蓝绿色。此溶液可长期贮存于棕色瓶中。
0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）溶液——称取0.5g TTC置烧杯中，加入少量95%乙醇溶解之，在容量瓶中用蒸馏水稀释至100ml。溶液应无色透明，避光保存，若发红色不宜使用。
三、实验步骤
1、溴麝香草酚蓝法（BTB法）
凡活细胞必定有呼吸作用，吸收空气中的氧，并放出二氧化碳，CO2溶于水成为碳酸（H2CO3）。H2CO3离解成H+和HCO3-，使种子周围环境的pH下降。BTB的变化范围为pH6.0-7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色（变色点为pH7.1），颜色差异显著，易于观察。用BTB指示酸度的改变，证实种子呼吸作用的存在。
制备0.8%BTB琼脂凝胶——取0.1%溶液100ml，置烧杯中，将0.8g琼脂剪碎后加入，用小火加热并不断搅拌（注意适当补水），待琼脂完全溶解后，趁热倒入一个干净的培养皿中，使其成为一均匀的薄层，冷却后备用。
取已吸涨的小麦种子50粒整齐的埋在凝胶中，并使种子间隔距离至少1cm；将培养皿好，置30-35℃培养2-4h；取出培养皿后，观察在蓝色凝胶中种子周围的颜色变化。如种胚附近呈现较深黄色晕圈者为活种子，否则是死种子。
2、氯化三苯四氮唑法（TTC法）
活种子在呼吸过程中都有氧化还原反应，而无生命力的种胚则无此反应。当TTC渗入种胚的活细胞内，并作为受氢体被脱氢辅酶（NADH2或NADPH2）上的氢还原时，便由无色的氯化三苯四氮唑变为红色的三苯基甲替（TTF）。
（1）将已吸涨的小麦种子用刀片沿种子的中心线切为两半。
（2）将种子的一半置一培养皿中，加入适量的0.5%TTC（以覆盖种子为度），置30℃恒温箱中0.5-1h。凡胚被染成红色的是活种子。
（3）将另一半种子在沸水中煮5min，将胚杀死，作同样处理，对照观察。
3．红墨水染色法
凡生活细胞的原生质膜具有选择性吸收能力，而死种子胚的细胞原生质膜丧失这种能力，染料进入死细胞，被染成红色。
（1）取已吸涨的小麦种子50粒，沿种子中心线切成两半，将一半置培养皿中，加入红墨水（以淹没种子为度），染色5-10min；另一半种子在沸水浴中煮5min，与上同样处理，作对照观察。
（2）倒去红墨水，用自来水冲洗种子多次，至冲洗液无色为止。凡种胚不着色或着色很浅的为活种子；凡种胚和种乳着色程度相同的为死种子。
4．纸荧光法
（1）许多植物体的各个器官，包括种子，富含各种荧光物质。在种子丧失生命的过程中，细胞膜阻止胞内物质外渗能力降低，荧光物质逐渐放出，根据这一原理可以区分种子有无生命力。此方法简便，并能克服种子粒小，药品昂贵的弊病。
将已吸涨的箩卜种子100粒，以3-5mm间隔整齐的排列在培养皿中的双层潮湿滤纸上。滤纸上的水分以稍有余滴为度，以免水分过多，荧光物质流失。
（2）放置1h后，将滤纸自然风干，并在紫外荧光灯下观察，能清楚的看到死种子周围有明亮的蓝色或蓝紫色光圈。
（3）将经高温（100℃烘烤）0.5h及低温（-40℃）过夜的种子各20粒用上述方法处理，同样观察比较。
（4）将步骤1样品中不出现荧光圈的种子拣出，排列于另一培养皿中，与步骤3的两种种子同时置于28℃下萌发，3-4天后观察，并统计萌发及不萌发种子数。
四、结果
1、 统计BTB法中受试种子周围出现黄色晕圈的数目，计算出发芽率。
2、 统计TTC法中受试种子总数及胚被染成红色的种子数。取两个人做的实验结果计算发芽率，并与BTB法实验结果进行比较。
3、 统计红墨水法中胚不被染成红色的种子数，取两个人所做实验的结果计算发芽率，并与BTB法、TTC法实验结果进行比较。
4、 统计纸上荧光法测定的种子发芽率，既记录荧光法中种子的总数、有荧光圈种子数、无荧光圈种子数、计算无荧光圈种子占种子总数的百分率（%）。
五、思考题
1、比较前三种方法所得发芽率。
2、试简单说明各种方法的原理在生理特点上有何异同。
实验15 萌发小麦种子内α-淀粉酶活力的测定
一、原理
淀粉酶几乎存在于所有植物中，尤其在谷物种子中活力最强。淀粉酶有两种，即α-淀粉酶和β-淀粉酶。通过两种淀粉酶的联合作用，淀粉最终被水解为麦芽糖。休眠种子中β-淀粉酶活力较高，α-淀粉酶活力随种子萌发天数增加而增强。两种淀粉酶的特性亦不相同，α-淀粉酶较耐热而不耐酸，在pH3.6以下则钝化；而β-淀粉酶较耐酸而不耐热，在70℃保温15min则丧失活力，但α-淀粉酶在此温度下却仍保持其活力。可利用这些特性的差异，分别测定两种淀粉酶的活力。本实验测定小麦种子在萌发前后α-淀粉酶的活力及最适pH。α-淀粉酶的活力以单位时间内产生的麦芽糖量计算。用3、5-二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。
二、材料和设备
1、 植物材料：未萌发和萌发3天的小麦种子干粉。
2、 设备：25ml具塞刻度试管；恒温消毒两用水浴锅；25ml试管及试管架；可见光分光光度计；吸量管（1ml、2ml、10ml）；100ml容量瓶。
3、 试剂：2%可溶性淀粉溶液；1mg/ml葡萄糖溶液；0.2mol/L Na2HPO4溶液；0.1mol/L柠檬酸溶液。
DNS（3、5-二硝基水杨酸）试剂——称取0.63g 3、5-二硝基水杨酸，溶于25ml 80%NaOH溶液中，加入50ml 25%酒石酸钾钠溶液，待溶解后，加入0.5g亚硫酸氢钠及0.5g重蒸苯酚，定容至100ml，贮藏于棕色瓶内，一周后使用。
三、实验步骤
1．α-淀粉酶的制备
称取未萌发和萌发3天的小麦种子磨成的干粉各两份，每份1000mg，放入20ml试管中，加10ml 40℃温水，于40℃水浴中提取1h，其间不断的搅动；保温结束后，过滤于25ml刻度试管中，并用40℃温水淋洗滤渣，冷却后定容到25ml刻度，于70℃恒温水浴中保温15min，以钝化β-淀粉酶，获得α-淀粉酶粗酶液。酶液贮存于4℃下备用。
2．葡萄糖标准曲线的制作
取12支25ml试管，分成两组，依次编号，向两组试管内依次加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml 1mg/ml葡萄糖溶液，并补水到1ml。然后向每支试管内加入2ml DNS试剂，于沸水浴中煮沸5min，取出后立即放入冷水中冷却。向每支试管内加入7ml蒸馏水，摇匀，以未加葡萄糖的处理作对照，于分光光度计上，用520nm光波测样品反应液的吸光度。
3．小麦种子萌发前后α-淀粉酶活力的测定
取8支25ml试管，分成甲、乙两组，依次编号。向两组试管内分别加入2ml未萌发和已萌发的小麦种子α-淀粉酶提取液；先将两组中的1、2号试管立即放入沸水浴中煮15min，冷却到室温作为对照处理；然后向甲、乙两组的试管（包括对照）内分别加入1ml 2%可溶性淀粉溶液，摇匀，于37℃水浴中保温20min；保温结束，立即将甲、乙两组试管（包括对照）转入沸水浴中煮15min，停止反应。
分别从各试管中取出1ml淀粉水解液，转入相应编号的空试管中，加2ml DNS试剂，沸水浴中煮反应5min，冷却，加蒸馏水7ml，以1、2号处理为对照，置分光光度计上，用520nm光波测样品反应液的吸光度。
表3 不同pH磷酸-柠檬酸缓冲液
pH 0.2mol/L Na2HPO4 0.1mol/L柠檬酸
（ml） （ml）
3.6 6.44 13.56
4.6 9.35 10.65
5.6 11.60 8.40
6.6 14.55 5.45
7.6 18.73 1.27
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4．小麦α-淀粉酶最适pH的测定
按照表3配制一系列不同pH的磷酸—柠檬酸缓冲液各20ml。取12支25ml试管分成两组，依次编号。向1号试管内加入5ml pH5.6的缓冲液、1mlα-淀粉提取液，立即煮沸15min，然后再加入1ml 1%可溶性淀粉溶液，此处理作为零时对照；向2-5号试管内依次分别加入表56-1中各种pH缓冲液5ml、1ml 1%的可溶性淀粉，1ml小麦种子α-淀粉酶提取液；于37℃恒温水浴中反应20min，然后转入沸水浴中加热15min终止水解反应，分别用吸量管从每支试管内取出1.0ml反应液，按制作葡萄糖标准曲线的方法测定各管反应液的吸光度值。
四、结果
1．以葡萄糖浓度为横坐标，以其对应的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2．根据测得的样品吸光度值，从标准曲线上查出样品中葡萄糖含量。将葡萄糖的含量乘以1.9得麦芽糖的含量。然后计算每克小麦种子萌发前后α-淀粉酶的活力。α-淀粉酶的活力单位为mg（麦芽糖）/h（小麦干粉）
样品麦芽糖含量(mg)-对照麦芽糖含量(mg)
α-淀粉酶的活力= ×稀释倍数
时间(h) × 小麦干粉重量(g)
3．比较小麦种子萌发前后α-淀粉酶的活力，这一结果说明了什么？
4．计算各种pH下，α-淀粉酶的活力，以酶活力为横坐标，其对应的pH为纵坐标，绘制酶活力与pH关系的曲线，分析该曲线的特点，求出α-淀粉酶的最适pH。
五、思考题
1、α-淀粉酶和β-淀粉酶的理化性质和生理功能有何区别？
2．小麦萌发前、后α-淀粉酶酶活力的变化的生物学意义？
实验16 植物发育过程中可溶性蛋白和过氧化物酶
及酯酶同工酶的凝胶电泳分析
一、原理
植物组织中的蛋白质，包括酶蛋白，都是基因表达的产物。不同植物在发育过程中，其不同组织和器官都有不同的形态特征和化学组成，其所含蛋白质的种类、比例均有所不同，同一种酶的同工酶也有所不同。植物的所有细胞内均含有同样的基因组成，即同样的DNA携带着同样的遗传信息。但是这些遗传信息的表达都是受到严格控制的。
由于不同的可溶性蛋白和同工酶的酶蛋白在结构上存在着差异，故可用分辨率很高的聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行分离，然后用组织化学染色的方法将它显示出来。
本实验用垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统分离可溶性蛋白及酶蛋白。该电泳是以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作支持物，依靠电泳基质的不连续性，即凝胶孔径的不连续性、缓冲液pH和离子强度的不连续性、电泳过程中形成的电位梯度的不连续性，使样品先在不同浓度的两层凝胶层之间浓缩成很薄的起始区带，然后进入分离胶中进行电泳分离。整个电泳过程中有3种物理效应起作用，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应，电泳过程中的电荷效应。由于这3种物理效应的共同作用，使该电泳具有灵敏、微量、分辨率高的特点。
二、材料和设备
1、 植物材料：5天苗龄的小麦幼苗或水稻幼苗。
2、 设备：垂直板凝胶电泳槽及直流稳压或电流源；注射器（0.1ml、1ml、10ml）；烧杯（50ml、250ml）；量筒（10ml、100ml、1000ml）；真空抽提装置1套；研钵；离心机；直径15cm培养皿；剪刀、镊子、滴管等。
3、 试剂：1-8号凝胶贮液（配制方法见表62-1）；0.1%溴酚蓝。
考马斯亮蓝染色液——称取0.2g考马斯亮蓝R250，用少量无水乙醇溶解，用含有40%乙醇和7%醋酸的水溶液稀释到200ml。
脱色液——400ml乙醇和70ml冰醋酸，加水到1000ml。
酯酶显色液——称取50mg α-醋酸萘酯，50mg β-醋酸萘酯，100mg坚牢蓝RR（或坚牢蓝B），先用约5ml丙酮溶解，再用0.1mol/L磷酸缓冲液(pH5.0)稀释到150ml。
过氧化物酶显色液——称取0.1g联苯胺，用少量无水乙醇溶解，再用0.1mol/L醋酸缓冲液(pH5.0)稀释到100ml，临用前加入几滴3%的H2O2。
三、实验步骤
1、 电泳槽的安装:本实验使用夹芯式垂直板电泳槽，它是由两半槽组成的方形电泳槽。两个半槽通过四只长螺栓固定
2. 凝胶的制备：按照表4的比例配制32ml分离胶。先将分离胶缓冲液（I）凝胶贮液（II）和水混合于烧杯中，抽气10min，然后加入催化剂过硫酸铵及四甲基乙二胺（TEMED），混匀，立即将凝胶液沿凝胶模子的的后面一块玻璃板的内壁缓缓地注入已准备好的胶室中。注胶过程要防止气泡产生。胶液加到离玻璃玻璃板顶部约3cm处，此时将电泳槽垂直放置，立即加水覆盖胶液，要缓慢注水，勿将胶面打乱，胶的聚合约需0.5h，聚合完成的标志是胶和水层之间出现清晰的界面。
按照表4的配方制备16ml浓缩胶：先将浓缩胶缓冲液、凝胶贮液和蔗糖（5、6、7号贮液）混合，抽气10min，借此用注射器吸去分离胶面上的水层。抽气后加入过硫酸铵和TEMED，立即将该混合液注入上述制备好的分离胶上，胶液加到接近胶室的顶部，插入梳子，静止聚合。胶聚合好后，小心地取出梳子，向样品槽内加入电极液备用。
3. 样品的制备和点样
取2g 5天龄的小麦幼苗，剪碎后放入研钵内，在冰浴中匀浆，匀浆过程中加入4ml稀释4倍的浓缩胶缓冲液（5号）。匀浆液在5000×g下离心10min，取2ml上清液与1ml 40%蔗糖溶液和半滴溴酚蓝溶液混合，用微量注射器吸取0.05ml混合液，注入样品槽内。按同样操作提取制备水稻样品溶液，将小麦和水稻样品相间点样，点样量可有所不同。
4. 电泳
加样后向两个电极液槽内注入电极缓冲液，接通电源，并立即电泳。前槽接入电源的负极，后槽接入正极。电泳开始后，电流控制在15—20mA，样品进入分离胶后可加大电流到30mA，这时电压一般在100V左右，此后，维持恒流不变。当指示染料到达离凝胶底部2cm时可停止电泳，电泳约需3h。
电泳到时后，关闭电源，吸出电极缓冲液，取出夹套和玻璃板。将两块玻璃板置于自来水龙头冲洗，借助水的润滑作用用解剖刀柄轻轻地从两块玻璃板缝间撬开两块玻璃板，将胶平放入15cm的大培养皿中。
5. 染色
可溶性蛋白的染色：将胶用水漂洗后，注入100ml考马斯亮蓝溶液于培养皿中，37℃下染色0.5h，染色到时后，用水冲去附去着于胶表面的染料，注入脱色液于室温下脱色。为了加快脱色，可经常更换脱色液或提高脱色温度，也可在振动床上进行。脱色直到背景清晰为止，约需24h。
过氧化酶显色：将100ml联苯胺溶液注入培养皿内，加入0.5ml 3%H2O2，室温下反应15min即可观察到棕红色的过氧化物酶同工酶区带。弃去联苯胺试剂，用蒸馏水冲洗，然后用5%醋酸固定保存。
酯酶同工酶的显色：将100ml酯酶显色液注入培养皿中，室温下显色约20min，可看到桃红色的磷酸酯酶同工酶区带。弃去染色液。用蒸馏水冲洗。可用5%醋酸固定保存。
四、结果
1、每人任选一种染色液显色，用彩色画笔画出可溶性蛋白和同工酶的电泳图谱。
2、比较小麦和水稻幼苗的可溶性蛋白或同工酶图谱间的差异，并作出简要的分析。
五、思考题
1、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
2、电泳过程中两个电极附近放出的是什么气体？气体的量有无差异？发生了什么反应？
3、 前后槽的电极液用过一次后，能否混合后供下次电极使用？为什么？
4、 同工酶和可溶性蛋白的电泳分析有何意义？
实验１７ 葡萄中可溶性糖含量的测定
一、原理
植物体中，特别在水果中，含有大量的糖，包括单糖、寡糖、多糖或其他糖类。蒽酮比色法是一个快速的定糖方法，游离的或多糖中的己糖、戊糖经浓硫酸处理，脱水生成糠醛或糠醛衍生物，该衍生物与蒽酮反应后，溶液呈蓝绿色，蓝色深浅与糖含量多少成正比。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，溶液呈红色。
二、材料和设备
1、 植物材料：葡萄的新鲜果实。
2、 设备：试管；吸量管；沸水浴；冰浴；分光光度计；150ml锥形瓶。
3、 试剂：0.1mg/ml葡萄糖溶液；80%乙醇；
蒽酮试剂——将760ml浓硫酸（比重1.84）用蒸馏水稀释至1000ml，加入2g蒽酮至溶解。
三、实验步骤
1、 制作标称曲线
取0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80ml 0.1mg/ml的葡萄糖溶液注入7支试管里，补水至1.00ml。加入4ml蒽酮试剂，迅速置于冰浴中冷却，待试管全部加完后，浸入沸水浴中，自沸腾开始准确煮沸10min，取出后用自来水冷却，在室温中平衡约10ml后，620nm处比色，以蒸馏水为对照。以糖浓度为横坐标，以吸光度A值为纵坐标作图得到标准曲线。
2、 样品中糖的提取和比色测定
（1）提取：取5g葡萄果肉（即去皮及核的新鲜果肉）置锥形瓶中，用25ml 80%乙醇提取30min，锥形瓶置80℃水浴中，不时摇动。取出后过滤，收集滤液，又以80%的乙醇提残渣二次，合并滤液，用水定容到500ml。
（2）样品含糖量测定：取0.1ml样品提取液于试管中，补水至1.0ml，加入4.0ml蒽酮试剂，按照标准曲线的测定方法，测定反应产物在波长620nm处的A值。若样品提取液中糖的含量较高，则须先稀释至标准曲线的工作范围内再进行测定。
四、结果
1、 据所测得样品的A值（如若有平行样品应取其A的平均值）在标准曲线上查出其相应的糖浓度。
2 、计算葡萄中糖的百分含量，即每100 g葡萄中含糖的克数。
五、思考题
1 、蒽酮法所测定的糖是哪一部分糖，为什么？
2 、如若样品提取液中含有较多的蛋白质时，可用哪些办法除去干扰？
实验18 番茄果实中果胶酶活性的测定
一、原理
果胶酶（pectase）是催化果胶物质水解的酶类。但果胶物质是原果胶（protopectin）、果胶酯酸(pectinic acid)和果胶酸(pectic acid)三种主要成分的混合物，因而果胶酶按其催化分解化学键的不同，可分为果胶酯酶（PE）和多聚半乳糖醛酸酶（PG）两种。
果胶酯酶催化果胶酯酸（即聚半乳糖醛酸甲酯）的酯键水解，产生果胶酸和甲醇。可用NaOH滴定酶解反应所产生的果胶酸来测定果胶酯酶的活力。
PG果胶酶催化水解果胶酸（即聚半乳糖醛酸）的1,4-糖苷键生成半乳糖醛酸。半乳糖醛酸的醛基具有还原性，可用亚碘酸法定量测定。以产生半乳糖醛酸的多少来表示此酶的活力。
二、材料和设备
1、植物材料：以成熟的西红柿果实为材料制备果胶酶粗酶液。
2、设备：研钵；恒温水浴；碱式滴定管；100ml锥形瓶；烧杯（50ml, 250ml）；量筒；移液管；1000ml容量瓶；玻璃漏斗；离心机
3、试剂：0.05mol/L NaOH溶液；1mol/L硫酸；100ml 0.5%可溶性淀粉溶液；1%NaCl溶液；0.5%中性乙醇（75%）溶液
1%果胶溶液—称取果胶粉1g于250ml烧杯中，加入100ml 0.5%NaCl溶液，加热溶解，过滤，冷却，补水到100ml。
0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液—称取12.41g硫代硫酸钠，用蒸馏水溶解后，用容量瓶定容到1000ml，一周后用重铬酸钾标定。
1mol/L Na2CO３溶液—称取53g无水碳酸钠，于烧杯内用水溶解，用容量瓶定容到500ml。
0.1mol/L I2-KI溶液----称2.5g KI溶于5ml水中，另取1.27g I2溶于KI溶液中，待I2全部溶解后定容到100ml，贮存于棕色试剂瓶中。
重铬酸钾溶液---将分析纯的重铬酸钾置于105℃烘箱内烤2h，移入干燥器内冷却到室温。准确称取重铬酸钾2.452g，用蒸馏水溶解，用容量瓶定容到1000ml,此液的浓度为0.0083mol/L。
硫代硫酸钠溶液浓度的标定---取3个100ml锥形瓶，各加入10ml蒸馏水、0.1g KI、10ml重铬酸钾溶液和1ml 1mol/l HCl于锥形瓶内，当KI溶解后立即用硫代硫酸纳滴定，当滴定到蓝色忽然消失，记录硫代硫酸钠的用量，求出平均值，计算硫代硫酸钠的浓度，有关反应如下：
K2Cr2O7 + 6KI +14HCl ─→ 8KCl +2CrCl3 + 7H2O + 3I2
2Na2S2O3 +I2 ─→ 2NaI + Na2S4O6
四、实验步骤
1．酶液的制备
取中度成熟的番茄果实（或其叶）25g，剪碎，加入25ml 1%NaCl溶液，匀浆，匀浆液全部转入离心管中，于5000×g离心10min。上清夜移入100ml容量瓶中，再用20ml 0.5%NaCl溶液提取沉淀两次，提取液并入容量瓶中，用0.5%NaCl溶液定容到100ml，此液为粗酶液。
2．果胶甲酯酶活力的测定
取20ml含0.5％NaCl的1%果胶溶液2份，放入100ml锥形瓶中，加入2滴中性红溶液，用0.05mol/L NaOH滴定到红色消失；将锥形瓶放入30℃恒温水浴中，预热3min，加入1ml 酶液(pH7.0)，摇动，立即计时，观察颜色的变化，待红色出现后，滴加0.05mol/L NaOH到红色消失。重复此步操作，实验进行30min，记录30min内滴加的NaOH量。加入的NaOH摩尔数，就是酶解后释放的游离羧基的摩尔数。
3．PG果胶酶活力的测定
取10ml 1%果胶溶液4份，分别放入250ml锥形瓶中，加5ml水，调pH到3.5；其中两瓶加入10ml pH3.5的酶液，另两瓶加入10ml预先沸分水浴中钝化过的酶液（pH3.5）作为对照处理，于50℃水浴中保温2h；反应结束后，取出锥形瓶，将两瓶含酶活性的样品放入100℃沸水浴中加热5min，然后用冷水冷却到室温。
向每瓶加入5ml 1mol/L H2CO３，20ml 0.1mol/L I2-KI溶液，加塞，室温下静置20min。待反应结束后，向每瓶假如10ml 1mol/L H2SO４。用0.05mol/L硫代硫酸钠继续滴定到淡黄色，加3滴0.5%淀粉溶液，再用硫代硫酸钠继续滴定到蓝色消失。
四、结果
1、 计算粗酶液中果胶甲酯酶的活力：以每ml酶液每min内释放1mmol CH３O-为1个酶活力单位。
酶活力单位（mmol CH３O-/min）= 0.05×V1/V2t
式中，0.05为NaOH的摩尔浓度；V1为消耗的NaOH ml数；V２为反应系统内加入酶液的体积(ml)；t为酶促反应时间（min）。
2、 计算酶的粗提液中PG果胶酶的活力：以每ml酶液1h内催化产生1mmol游离半乳糖醛酸为1个酶活力单位。
每ml酶液活力单位（mmol半乳糖醛酸/h）＝（B-A）×m×0.51/(E×t)
式中，A、B分别为样品和对照消耗硫代硫酸钠ml数；m为硫代硫酸钠的摩尔浓度；E为反应系统内加入酶液ml数；t为酶促反应时间（h）；0.51为1mmol硫代硫酸钠相当于0.51mol游离半乳糖醛酸。
五、思考题
1、果胶酶在果实成熟过程中有何生理作用?
2、PG果胶酶活力测定中为什么选择pH3.5，50℃下进行，这些条件如何确定的?
实验19 切花的延衰保鲜
一、原理
切花指切离植株母体的花、花序或带花的枝条。由于营养源被切断和机械损伤等原因，促进了与衰老有关的内源激素乙烯的合成，加速了切花的衰老过程，致使切花要比在植株上的花衰老得更快，影响观赏价值，因而对切花延衰保鲜的研究有着重要的意义。目前用于切花保鲜的试剂主要有银盐和8-羟基喹啉等化合物。银离子是乙烯生成的对抗剂，可阻止与乙烯合成有关的酶的合成，另外也可阻止切花ABA含量的增加，有延缓切花衰老过程的作用。8-羟基喹啉是一种抗蒸腾剂，可促进气孔关闭，减少蒸腾，有利于维持切花水分平衡，防止凋萎。此外，银离子和8-羟基喹啉还有强烈的抑菌和杀菌作用。本实验观察硫代硫酸银（简称STS）和8-羟基喹啉柠檬酸盐（简称8-HQC）对金鱼草和矮牵牛切花的延衰保鲜作用。
二、材料和设备
1．植物材料：盛花期的金鱼草（俗名龙头花）或矮牵牛
2．设备：试管及试管架；烧杯；吸量管；量筒；剪刀；微量吸量管。
3．试剂：2mmol/L硝酸银溶液—称取85mg AgNO3，用蒸馏水定容到250ml。
8mmol/L硫代硫酸钠溶液—称取496mg Na２S２O3•5H２O，用蒸馏水定容到250ml。1mmol/L硫代硫酸银(Ag２S２O３)溶液—临用前将上两试剂等体积混合即生成1mmol/L硫代硫酸银；300mg/L 8-羟基喹啉柠檬酸-蔗糖溶液—称75mg 8－HQC，溶于250ml 2%蔗糖溶液中。
三、实验步骤
1、 取20支25ml试管，分2组。第1组加蒸馏水，第2组加8-羟基喹啉柠檬酸盐-蔗糖溶液，各组分别编号。
2、 从植株上选取20 支花序或带花和带叶的枝条（简称花枝），每个花序或花枝上带有1朵刚展开的花，花的生理年龄尽可能一致。用剪刀于距花5-10cm处将花序或花枝剪下，立即插入盛有蒸馏水的烧杯中，然后在水中于花序或花枝基部作第二次剪切，剪切的长度约1cm，以防空气进入花茎的输导组织。
3、 将10支花序分别插入第1组各管中，花序浸入溶液内4-5cm；另外10支花序插入盛有STS溶液的烧杯中，0.5h后，将它们分别插入第2组试管中；然后，用记号笔标上试管内液面的高度，逐个记录所观察的花的生理状态。
4、 另外从植株上选取5朵刚开放的花，其生理上要与切花处于相同的发育阶段，也作上标记，作为第3组实验，观察自然状态下花的正常寿命。
5、 记录3组实验中每朵花或花序的状态，此后，每两天观察一次，直到所有的花凋谢为止；每次观察后补水到原来的高度。
四、结果
1． 统计3组花开放天数，并比较和分析STS和8-HQC-蔗糖对切花寿命的影响。
2． 观察并比较各组实验中花的大小、形态和花蕾发育的情况。
五、思考题
1、 促使切花衰老的原因有哪些？
2、Ag+和8-HQC对切花保鲜作用的机理是什么？
3、实验中为什么用硫代硫酸银而不用硝酸银？
4、如何进一步延长切花的保鲜期？你认为还可采取哪些措施？
5、切花保鲜的研究有何意义？
实验20 干旱和盐度对植物体内
游离脯氨酸积累的影响
一、原理
生长在干旱和盐碱环境中的植物，体内常积累游离的脯氨酸，而游离脯氨酸积累的量又往往和环境干旱的程度、盐度和植物对干旱和盐度的抵抗力（抗逆性）有关。因而，测定植物体内游离脯氨酸的含量，在一定程度上可从生理上了解植物受环境水分和盐度胁迫的情况，了解植物对水分和盐分胁迫的忍耐和抵抗能力，在生产和育种学上有一定的意义。
植物体内脯氨酸的含量可用酸性茚三酮法测定。脯氨酸和酸性茚三酮试剂反应生成稳定的红色产物，该产物在515nm有最大吸收峰，其色度和脯氨酸的含量成线性关系，可用分光光度法测定。该反应具有较强的专一性，酸性和中性氨基酸不能与酸性茚三酮试剂形成红色产物，碱性氨基酸对这一反应有轻度干扰，但可加入人造沸石排除这种干扰。
二、材料和设备
1、植物材料：将小麦种子在20℃下浸泡24h，播入铺有滤纸的大培养皿中，生长3-4天后作如下处理：（1）供给充足的水分。（2）加入100mmol/L NaCl溶液。（3）加入200mmol/L NaCl溶液。三种处理于20℃，5000 lx光照下培养，每天用处理液更换培养皿中的溶液，连续处理5天；将盆栽两周龄的小麦幼苗分成两组，一组供给充足的水分，另一组控制供水，使其处于中度萎蔫状态，连续处理一周。
2、设备：分光光度计；水浴锅；振荡混合器；研钵；直径15cm的大培养皿；25ml试管及试管架；25ml刻度试管；玻璃漏斗；剪刀；吸量管
3、试剂：100mmol/L和200mmol/L NaCl溶液；80%乙醇；20ug/ml脯氨酸溶液
酸性茚三酮试剂：2.5g重结晶茚三酮，加入60ml冰醋酸，40ml 6mol/L磷酸，于70℃加热溶解，冷却后置于棕色瓶中，4℃保存，两天内稳定。
三、实验步骤
1、 脯氨酸标准曲线的制作
在1-10ug/ml脯氨酸浓度范围内制作标准曲线。取标准溶液各2ml，加入2ml3%磺基水杨酸、2ml冰乙酸和4ml2.5%茚三酮溶液，置沸水浴中显色60min。冷却后，加入4ml甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相测定520nm波长处的吸收值，依据脯氨酸量和相应吸收值绘制标准曲线。
2、NaCl对小麦幼苗内游离脯氨酸积累的影响
（1）样品的提取：取0.05—0.5g用不同浓度NaCl处理过的小麦叶片，各3份，一份用于测定干重，两份用于脯氨酸的测定。用3%磺基水杨酸溶液研磨提取，磺基水杨酸的最终体积为5ml。匀浆液转入玻璃离心管中，在沸水浴中浸提10min，冷却后，以3000r/min离心10min,取上清液待测。
（2）样品测定：取2ml上清液，加入2ml水，再加入冰乙酸等显色试剂，同标准曲线程序进行显萃取和比色。
3、水分胁迫对小麦幼苗中游离脯氨酸积累的影响
按照上述测定小麦幼苗中游离脯氨酸含量的程序，测定不同供水处理的小麦幼苗中游离脯氨酸的含量，每种处理称取3份，一份用于测定干重，二份用于测定脯氨酸含量。
四、结果
1．根据样品吸光度测定的结果、稀释倍数和重量，计算各种处理的小麦幼苗，每克鲜重及干重样品中游离脯氨酸的平均含量。
2．根据你的实验结果，分析盐度与小麦幼苗中游离脯氨酸含量的关系。
3．根据你的实验测定结果，分析水分胁迫与植物体内游离脯氨酸积累的关系。
五、思考题
1、 植物体内游离脯氨酸的测定有何意义？
2、本实验可用甲苯代替苯萃取脯氨酸与酸性茚三酮试剂反应产生的红色产物。你认为选哪个试剂更好？为什么？用不同的试剂萃取，产物的最大光吸收有时会有微小的变化，你如何确定选用什么波长进行吸光读测定？
