龚宁 张传博 编
实验一、植物愈伤组织的诱导
一、 实验目的：
通过本实验学习植物组织培养的一般方法。
植物组织培养是60年代以来植物细胞生物学中发展起来的一项生物技术。它是借用无菌操作方法，培养植物的离体器官、组织或细胞，使其在人工合成的培养基上，通过细胞的分裂、增殖、分化、发育，最终长成完整再生植株的过程。
植物组织培养技术的研究，不仅具有重大的理论意义，而且在生产实践中也已显示了广阔的应用前景。组织分化与形态建成问题，快速繁殖与去除病毒、花药培养与单倍体育种、幼胚培养与试管受精、抗性突变体的筛选与体细胞无性系变异、悬浮细胞培养与次生物质生产以及超低温种质保存等方面的深入研究和实际应用，都必须借助植物组织培养技术的基本程序和方法，深刻理解植物细胞的全能性。
二、 实验用品
（一） 材料：胡萝卜等
（二） 仪器：
高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱或培养室、电炉
（三） 用具
镊子、解剖刀、接种针、牛皮纸或塑料薄膜、玻璃铅笔或记号笔、橡皮筋、打火机、酒精灯4个、广口瓶4个、Ph试纸（5·4-7·0）等
（四） 玻璃器皿
试剂瓶（50、100、1000ml）、量筒（10ml 3支，100ml 1支）、烧杯（1000ml 1个/组，100ml 1个/组）三角瓶（100ml）、移液管（0·5、1、5、10ml）、培养皿（直径9-11cm）。
（五） 药品与试剂
1、 药品（见表1）
2、 70%酒精
3、 0·1%升汞
4、 1mol/L NaOH 50ml（装入滴瓶备用）
5、 1mol/L HCl 50ml（装入滴瓶备用）
6、 琼脂、蔗糖。
三、 实验方法
（一） 培养基的配制
A、培养基基础
配制培养基前先要配制母液。母液分大量元素、微量元素、铁盐及有机物质四类。（各类成分、浓度、用量祥见表1）。
1、 大量元素母液（10倍液）
分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容止1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用。）
2、 微量元素母液（100倍液）
分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定容到1000ml。
3、 铁盐母液（100倍液）
称取100倍用量的Na2-EDTA和FeSO4·7H2O，容于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml
4、 有机物质母液（100倍液）
分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。
除了上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生长素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。
5、 生长素
如2，4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。
6、 细胞分裂素
如激动素（Kt）、6-苄基嘌呤（6-BA）。准确称取20mg，先用2ml的1mol/L HCl或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。
表1、MS培养基母液配制 （单位：mg）
|
类
别 |
成分 |
规定量 |
称取量 |
母液体积
（ml） |
扩大倍数 |
配1L培养基的吸取量（ml） |
|
大
量
元
素
|
KNO3
NH4NO3
MgSO4·7H2O
KH2PO4
CaCl2·2H2O |
1900
1650
370
170
440 |
19000
16500
3700
1700
4400 |
1000 |
10 |
100 |
|
微
量
元
素
|
MnSO4·4H2O
ZnSO4·7H2O
H3BO3
KI
Na2MoO4·2H2O
CuSO4·5H2O
CoCl2·6H2O |
22.30
8.6
6.2
0.83
0.25
0.025
0.025 |
2230
860
620
83
25
2.5
2.5 |
1000 |
100 |
10 |
|
铁
盐 |
Na2-EDTA
FeSO4·7H2O |
37.25
27.85 |
3725
2785 |
1000 |
100 |
10 |
|
有
机
物
质
|
甘氨酸
盐酸硫胺素
盐酸吡哆素
烟酸
肌醇 |
2.0
0.4
0.5
0.5
100 |
100
20
25
25
5000 |
500 |
100 |
10 |
B、培养基的配制与分装
1、 取1000ml烧杯一只，加入约700ml蒸馏水，置电炉上加热，将剪碎的琼脂8g加入烧杯中，继续加热，待琼脂基本融化后加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml，有机物质100倍母液10ml。此外，根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素、细胞分裂素和蔗糖等，然后加水至1000ml，待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8。
2、 将培养基分装到培养用的三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。
3、 将牛皮纸裁成适当大小的长方形，折起来使成正方形，紧密裹在瓶口上，用橡皮筋扎紧，随后便可进行灭菌。
培养基的种类和附加成分是根据培养物的种类，外植体的来源以及具体的实验目的和要求来确定的。下列经验可作为实验的参考：
MS+2，4-D2·0+蔗糖3%+琼脂0·7% 作为胡萝卜愈伤组织诱导培养基
C、 培养基的灭菌
把装好培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖，打开放气阀，接通电源，进行加温，待有大量蒸气放出（即锅内冷空气完全排出）时，关上放气阀，等气压升到9.9×104Pa(15磅)时,在9.9×104-1.3×105Pa(15-20磅)下高压灭菌15-20分钟.断开电源,缓慢放气,使锅内蒸气完全放出,打开锅盖,取出培养瓶,置接种室凝固备用。自来水、镊子、剪刀、解剖刀、培养皿等同时灭菌。
（二）取材、消毒与接种
1、 取材与消毒
取正常收获季节的胡萝卜贮藏根，洗净。在无菌条件下操作，先将胡萝卜根于70%酒精中浸沾数秒，再浸于0·1%升汞液中消毒10min后以无菌水冲洗3-4次。用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层，切成0·5cm2的小块，接种于培养基内。
2、接种
先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽，再用70%酒精擦抹工作台台面。放入培养瓶和接种用具（接种用的镊子、解剖刀、接种针及培养皿等），点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭手臂。把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。打开三角瓶，将材料植入培养基内，重新盖上牛皮纸，扎上橡皮筋，用玻璃铅笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号，标明接种日期。
全部接种工作都要在严格无菌条件下进行，所以要特别认真、仔细、以防杂菌污染。
（三）培养与观察
接种完毕后取出培养瓶，置23-25℃恒温培养室内，黑暗或弱散射光条件下培养，定期进行观察。
实验二、鸡胚成纤维细胞的制备
[材料]：
1.孵育9～12日龄鸡胚2只
2.培养基：含10%小牛血清（CS）的MEM，无钙镁Hanks液（CMF－Hanks），0.25％胰酶/CMF-PBS, CS等。
3.各种吸管、60mm平皿、三角烧瓶、离心管、100目尼龙网或不锈钢网、镊子、眼科剪、细胞计数器一套、显微镜、0.3％台盼蓝、培养瓶等。
[方法1]：
1.取胚： 取9～12日龄鸡胚于蛋架上，用碘酒、酒精消毒气室部，用剪刀去除气室部蛋壳，用无菌弯头小镊轻轻取出鸡胚于无菌平皿中。
2.组织处理：将鸡胚头、爪、内脏去除，留下的鸡胚组织用Hanks液洗2次，以除去红细胞，然后将鸡胚组织移入小三角烧瓶内，用剪刀剪成1mm3大小组织块，用Hanks液洗2次。
3.胰酶消化：将洗液上清吸弃，根据沉下的鸡胚组织块的多少，加入10倍量的0.25％胰酶（PH7.4），置于37℃水浴中消化15～30min，至组织碎块聚合成一团，边缘毛样模糊即可。取出后用毛细管轻轻吸出消化液，用Hanks液洗1～3次。加10ml生长液（不加血清），用吸管反复吹打，使细胞分散，然后将分散好的细胞悬液通过不锈钢筛网，补齐10％CS或加10％的胎牛血清（FBS）.
4.细胞的计数与分装：取上述获得的单细胞悬液少量，进行5倍或10倍稀释后计数，调至细胞浓度约（0.5～1）×106/ml，分装培养瓶内。也可估算细胞浓度，一只10日龄鸡胚制成10ml细胞悬液时细胞数约为4×106/ml，也可视悬液的透明度来估计。。
5.培养及观察：将上述培养物置37℃孵箱内培养，每日观察细胞生长情况，一般与2～3天可长成单层细胞。
[方法2]：
取处理好的组织块，加入0.25%的胰蛋白酶浸泡消化，放置37℃暖箱中，磁力搅拌器以100rpm搅拌15～30min（这一步可根据需要加入其他酶），收集细胞团，将细胞悬液倒入收集管（瓶中加入适量胎牛血清）重新加入胰蛋白酶到含组织块的瓶中，重复上述步骤。反复收集细胞悬液，直到组织块完全解离，或组织块不再解离，可终止消化。
合并收集瓶中的细胞悬液，将收集容器中的细胞悬液放入离心管100rpm，5分钟离心收集细胞，弃上清，加入完全培养基于细胞沉淀，悬浮。
用血球计数器计数细胞数和用台盼蓝排斥实验检查细胞活力，根据活细胞计数，用生长培养基稀释活细胞浓度达2×105/ml，每培养瓶加入3ml（液体占1/3空间），放置37℃ CO2培养箱。细胞接种量可适当增加，不可减少。
通常2天内，不必更换培养基（细胞可自分泌生长因子，有利于细胞贴壁生长）。当细胞生长成单层后，需换液。
实验三、兔肾细胞的培养
[材料]：
1. 兔婴（出生48h内尚未进食兔婴，）
2. 培养基与试剂：含10%FBS（或CS）的MEM，无钙镁Hanks液，0.25％胰酶/CMF-PBS, 等。
3. 器皿：各种吸管、60mm平皿、三角烧瓶、离心管、100目尼龙网或不锈钢网、镊子、眼科剪、细胞计数器一套、显微镜、1％新洁尔灭消毒缸、培养瓶、解剖板等。
[方法]：
1.取肾： 取2日龄内兔婴，用颈椎错位法处死，放入1％新洁尔灭溶液中浸泡10min,用碘酒、酒精消毒腹部皮肤，解剖取肾，除去肾被膜，放无菌平皿内，用Hanks液洗净。
2.组织处理及消化：剪下肾皮质部分，移入小三角烧瓶内，用剪刀剪成1mm3大小组织块，用Hanks液洗3次。吸弃上清液，根据沉下的组织块量，加入10倍量的0.25％胰酶（PH7.4），置于37℃水浴中消化30min，以下步骤及方法与鸡胚细胞制备相同。
附：
实验仪器及试剂的配制
一、大型实验仪器设备：
1. 无菌室、超净工作台、无菌操作箱、
2. CO2培养箱、恒温培养箱、培养架、培养盘、试管架。
3. 倒置显微镜、普通显微镜及照相系统、离心机等
二、消毒灭菌
1. 高压蒸汽灭菌器
2. 干热灭菌器
三、溶液配制用具
1. 蒸馏水制作系统
2. 电子分析天平
3. PH仪
4. 量桶、量杯、容量瓶、
5. 玻璃滤过器
四、制备细胞用品
1. 解剖板、各种吸管、三角烧瓶、眼科剪、弯头镊子、培养皿（60mm）、培养瓶、100目尼龙网或不锈钢网
2. 细胞计数器
五、主要试剂及其配置
1.Hanks液
10×浓缩液
溶液1. 取450ml三蒸水，NaCl 80g、 KCl 4g、MgSO4.7H2O 2g、CaCl2 1.4g（2H2O者1.85g）
完全溶解后，补足蒸馏水至500ml
溶液2. 取500ml三蒸水，Na2HPO4 0.6g、KH2PO4 0.6g、葡萄糖 10g、0.4％酚红 50ml
取溶液1和溶液2等量，用蒸馏水稀释10倍，即成使用液。临用时，用7.5% NaHCO3调至所需的PH值，并高压灭菌。
3. MEM（低限量Eagle培养基）
MEM粉末（9.4g）、谷氨酰胺（0.292g）、NaHCO3
4. 0.25％胰酶（PH7.4）
胰酶粉末、D-Hanks液
4.小牛血清（CS）、胎牛血清（FBS）
5. 生长液：
RPMI－1640 87％ 小牛血清 10％
（100×）谷氨酰胺 1% （100×）双抗 1％
用5.6％ NaHCO3 调PH值至7.0～7.2
6. 碘酒、75％酒精、1％新洁而灭
材料：鸡胚（9～12日龄）兔婴（48h）
