《微生物学实验》教案
授 课 人：牛晓娟
授课对象：2016级生物科学、
生物技术、生物工
程、园艺专业
2017年7月
《微生物学》实验课教案
一、目的要求
训练学生掌握微生物学最基本的操作技能，了解微生物学的基本知识，加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时通过实验课教学提高学生动手能力及观察、解决、分析问题的能力，培养严肃认真、实事求是的科学态度。
二、实验室规则
微生物学实验是一个严肃的实验场地，虽然普通微生物学实验所用的微生物材料一般为非致病菌或条件致病菌，但许多微生物是否具有致病性不是绝对的，预期数量、条件、感染途径等有关，为了上好微生物学实验课，并保证安全，特制定如下规则和安全措施：
（一）每次实验前应对实验内容充分预习，并到生物学实验教学中心网站（http://skysyzx.gznu.edu.cn/）查看实验相关视频和课件，了解实验目的、原理和方法。
（二）学生应按规定时间进入实验室。保持实验室安静，不得进行与实验无关的活动。
（三）事先准备好实验用的材料和工具，实验后清洗干净，查点清楚，原样放回。
（四）每次的实验报告应在教师指定时间内完成。
（五）实验结束，于离开实验室前，应清理好自己的实验桌，要轮流打扫实验室，保持整洁。
（六）爱护实验室的一切物品，避免损坏或浪费。损坏物品时，应主动向教师报告。
和操作步骤。把必需的实验用品带到实验室。
(二)实验开始时应认真听教师的讲解。
三、实验报告
(一)除绘图外，实验报告还包括解答实验指导中提出的问题和必要的记录等，并应把它写在笔记本上。
(二)实验报告须用钢笔或圆珠笔书写，两行之间应留适当空隙，以便教师修改，每次实验报告及笔记均另起一页。
实验一 培养基的制备与消毒灭菌
教学目标
1．了解微生物培养基性质和配制方法。
2．了解几种常用灭菌原理以及方法。
教学重点
1、配制培养基的原理与方法
2、常用灭菌方法和注意事项
教学方法
课堂讲授、指导学生操作
课时安排
4课时
实验器材
1、溶液和试剂
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/L NaOH，1mol/L HCl，KH2PO4，MgSO4·7H2O，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O，FeSO4·7H2O，葡萄糖，琼脂，孟加拉红，链霉素
2、仪器和其它用品
试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，药匙，pH试纸，纱布，高压蒸汽灭菌锅等
课程内容
牛肉膏蛋白胨培养基的制备
一、实验原理
（一）培养基的配制
培养基——是按照微生物生长繁殖所需要的各种物质，用人工方法配制而成的一种基质（也就是讲，这种培养基是微生物的食物），培养基中含有C、N、无机盐、维生素以及水，这些成分提供了微生物能源以及新陈代谢中所起的调节作用，从而来合成细胞物质。由于微生物营养种类不同（营养类型不同），它们对营养物质的要求也各不相同。因此需要配制各种不同的培养基，以适应各种微生物对营养的要求。
配制培养基除了考虑上面提到的营养要求外，还需要考虑微生物生长的其它条件，如适应的酸碱度（PH），渗透压等。因此根据不同微生物对酸碱度的要求，需要将培养基调到一定的pH范围（象细菌和放线菌适应在偏碱性的条件下生长，一般在配制培养基时，将pH值调到7.2~7.6左右，而真菌适应在偏酸性的条件下生长，一般在配制时把培养基调到4.5~6.0，通常pH自然）。
其次根据培养基所选用的营养物质的来源不同，可将培养基分为：①天然培养基、②半合成培养基、③合成培养基；另外按照培养基物理形状的不同，可将培养基分为：①液体培养基、②固体培养基、③半固体培养基三种形状。固体培养基和液体培养基所含的营养成分相同，不同处，只是在液体培养基中加入一种凝固剂作支持物，我们通常用的支持物是1.5~2%的琼脂（洋菜），但也可用明胶和硅胶等。因明胶和硅胶容易被大部分微生物分解，因而不常用，以及根据培养基使用的目的不同，又将培养基分为：①繁殖培养基、②保存培养基、③加富培养基、④选择培养基、⑤鉴别培养基等。使用培养基的原则是根据不同的微生物和不同的目的来选择所需要的培养基。
二、操作步骤
牛肉膏蛋白胨培养基的制备
1．称量
按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。（牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，水1000mL，琼脂15-20g）
2．溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
3．调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.4-7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。
对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。
4．过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验无需过滤）。
5．分装
按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(1)液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。
(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
(3)半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
6．加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。
7．包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
8．灭菌
将上述培养基以0.1MPa，121℃，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9．搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10．无菌检查
将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。
高氏1号培养基的制备
配方：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O，MgSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，琼脂15-25g，水1000ml，pH7.4-7.6
（1）称量与溶化：按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少量所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次溶化。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入，方法是现在100mL水中加入1gFeSO4·7H2O，配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mLde 0.01g/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补足水。如要配置固体的培养基，溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基的制备。
（2）剩下步骤同牛肉膏蛋白胨培养基的制备
马丁氏培养基的制备
马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4
·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。
配方：KH2PO4 1g
MgSO4·7H2O 0.5g
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
琼脂 15—20g
水 1000ml
pH 自然
此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时每100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml。
灭菌和消毒（disinfection & sterilization）
灭菌和消毒是微生物学实验中最常用的基本技术之一。
灭菌——是应用物理和化学的方法杀死物品上或环境中的所有微生物的细胞和芽孢。一般可用高温过滤或其它的物理、化学方法使器皿、培养基或溶器中的所有微生物的细胞及芽孢完全杀死或除去。指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。
消毒——是应用物理和化学的方法杀死物体上绝大部分微生物（特别是病原微生物），物品经消毒处理后，虽然有少数微生物未被杀死，但已不致引起有害作用。一般指消灭病原菌和有害微生物的营养体。
灭菌的方法可分为四大类：（1）加热灭菌、（2）过滤除菌、（3）辐射灭菌、（4）化学药品灭菌。虽然灭菌的方法有很多种，但由于灭菌的对象不同，实验的目的不同，所采用的灭菌方法也有所差别。例如，一般玻璃器皿可采用干热灭菌、培养基可采用高压蒸汽灭菌、对某些不耐高温的培养基则用间歇灭菌或过滤灭菌，无菌室、无菌罩等一般用紫外线或化学药剂处理，如甲醛喷雾或蒸熏等方法灭菌。
本实验只讲加热灭菌。加热灭菌又分为干热灭菌和湿热灭菌两类。
1.干热灭菌
干热灭菌又分为火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。
（1）火焰烧灼灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，对接种环、接种针、玻棒或其它金属用具如镊子、解剖刀等采用此方法灭菌。
（2）干热灭菌（热空气灭菌）
是在电烤箱内利用高温干燥的热空气（160~170°C）使物体升温，然后导致物体上所带的微生物由于干热脱水（细胞内的蛋白质凝固变性）而死亡，这种方法常用于玻璃器皿等用具的灭菌。对于橡胶制品、塑料制品以及培养基等不能用此法灭菌。其过程如下：
①将要灭菌的器皿（培养皿、试管、吸管等）用报纸包扎好，放入烘箱内。
②接通电源，拨开开关，打开电烘箱排气孔，旋开恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100°C时，关闭排气孔，在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内温度停止加温，此时如果还未达到所需的160~170°C，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需的温度。旋动恒温调节器到160℃，当到此温时，借助于恒温调节的自动控制，保持恒温2小时。
③时间一到，关掉电源，当温度降到大约40~50℃（<70°C）后，打开箱门，取出器皿，并将调节器旋转到“0”。
注意事项：
①灭菌物品在箱内不能堆放的太满，一般不要超过总容器的2/3，灭菌物品之间应留有一定空隙。灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以免包装纸烤焦起火。
②灭菌的器皿必须干燥，否则容易破裂。
③灭菌的温度不能超过180℃，否则棉花和纸等要烧焦，甚至发生事故，所以，在使用时，要随时检查温度情况，以防止自动恒稳调节器失调。
④灭菌后，如温度没降下就打开箱门，冷空气突然进入箱内，玻璃器皿就破裂。
2.湿热灭菌
湿热灭菌又分为高压蒸气灭菌、常压蒸气灭菌、巴斯德消毒法、煮沸消毒法和超高温杀菌等。本实验只讲高压蒸汽灭菌。
高压蒸气灭菌是根据蒸气温度随压力的增加而提高，压力越大，温度越高的原理。高压蒸汽灭菌是在密闭的高压蒸气灭菌锅中进行的。在此密闭容器中，加热使灭菌锅隔套间的水沸腾产生水蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱除尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到了高于100℃的蒸气温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸汽有潜热存在。在1g水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26KJ的热量。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸汽温度。
一般将灭菌器中压力提高一个压力（即15磅/平方时或1.05公斤/平方厘米），灭菌15~30分钟，此时的温度是121.5℃，则可达到完全灭菌的要求。其过程如下：
①首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。）
②放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而投入棉塞。
③加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内，再以两两对称得方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
④打开加热开关，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。（灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力）
⑤灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。(压力一定要降到0时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者)
⑥将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
3．灭菌→无菌检查
作业
1．按成分的不同可将培养基分为哪几种？
2．按培养基的物理状态又分为哪几种？
3．牛肉膏蛋白胨培养基是否要调pH？调到多少？
4．培养基、无菌水等用哪种灭菌方法？
5．热空气灭菌所需要的时间和温度分别是多少？
6．热空气灭菌和高压蒸汽灭菌适应于哪些物品的灭菌？
准备工作：
每组6个-7个人，一张纱布一团棉花，3个250ml三角瓶，一个100ml三角瓶并放玻璃珠，一个搪瓷缸和一根玻棒，6根棉线绳，6根18*180试管，18套培养皿，1根10ml吸管和洗耳球，3张报纸，裁好的报纸条牛皮纸4张，1ml吸管6根，一个带游码的天平，线球一个，配制培养基所需药品，药匙勺、pH试纸等。
操作步骤：第1、2组配制400-500ml牛肉膏蛋白胨培养基分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第3、4组配制高氏1号培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。第5、6组配制马丁氏培养基400-500ml分装于3个250ml三角瓶中，加棉塞用牛皮纸包好，注上培养基名称、班级组号。每组每人装9ml自来水放入试管中，做一个棉塞，给带有玻璃珠的三角瓶加入45ml自来水，包培养皿3包每包6-7套（看每组人多少而定），每人包吸管一根，注上班级组号。
实验二 微生物的分离与纯化
教学目标
1．初步掌握微生物的分离、培养的基本方法。
2．练习微生物接种移殖和培养的基本技术。
教学重点
分离纯化的基本操作技术。
教学方法
课堂讲授
课时安排
4课时
教学过程
一、实验原理
（一）微生物的分离
微生物的分离是微生物学中的一个最重要的基本技术，因此要求熟练地掌握。
工农业及科学实验上所用的微生物菌种，最初都是从自然界筛选出来的。自然界的微生物种类非常多，分布极广，要从自然界找到我们需要的特殊菌种，就必须把它们从许许多多不同的杂种中分离出来。然后根据生长上的要求和菌种的特性，用各种不同的筛选方法，挑选出性能良好符合生产科研要求的纯种。
什么叫微生物的纯培养呢？就是在一种培养物中只生长一种微生物，而绝对没有其它微生物混杂其内，所产生的后代。到什么地方可以采到含有我们所需要的菌种的样品呢？这要根据所需菌种的特性和其它有关因素而确定。一般地说，土壤中是菌种取样的主要源泉。但其它地方也有，如污水、动物粪便以及动植物的病原组织等也有大量的微生物存在。例如我们要筛选分解纤维素的微生物，首先就要考虑分解纤维素的微生物和纤维素的关系，纤维素是分解纤维素微生物的物质基础，离开纤维素就无所谓对纤维素进行什么分解了，因此要筛选分解纤维素的微生物就要到有纤维素腐烂的地方采集样品，才能筛选到分解纤维素的微生物。又如，要分离固氮菌，我们就要根据固氮菌生活的特性，到富有肥沃的pH偏碱的土壤中采样，这样就能分离出我们所需要的固氮菌。
在自然界中微生物几乎都是混杂在一起的，必须从土壤中或其它基质中将所需要的微生物分离出来供生产和研究的需要，由于微生物对营养、酸碱度、氧气的要求不同，当供给它们适当的生活环境条件，以有利于有些微生物的生长，又抑制或淘汰了其它杂菌。再用各种分离方法，使它们在固体培养基上形成单个菌落，便可得到纯种，最常用的是稀释分离法，这种方法是将含有微生物的物质，用水稀释使一定量的液体中含有的微生物在固体培养基表面上发育成个别菌落的可能，然后再挑选单独的菌落。用无菌操作方法移殖在适应的培养基上，而获得纯种。分离的成功与否，决定于四个条件：（1）稀释度的选择；（2）营养条件；（3）环境条件；（4）操作过程是否严格遵守无菌手续。
需要指出的是从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
（二）接种方法
微生物的接种方法，常用的有斜面接种、平面接种、液体接种、穿刺接种等。常用的接种工具有接种环、接种针、接种产铲、接种钩和三角玻璃棒等。不同接种方法，使用不同的接种工具。接种是在接种室或净化工作台上进行，接种室或净化工作台事先用紫外线或化学药剂灭菌。
（三）微生物的培养
微生物的培养是微生物学一项重要的技术，培养方法有好气培养和厌气培养两种方法。真菌、放线菌和大多数细菌都是需要好气培养，厌气性细菌则相反，要求隔绝空气的条件下进行厌气培养。
二、实验器材
每组：土样10g，米曲霉、装90ml无菌水的三角瓶，装9ml无菌水的试管5支，培养皿9套，无菌吸管等。
三、实验步骤
（1）制备土壤稀释液
称10克土样 → 90m无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中 → 摇动20分钟，静止半分钟，无菌吸管吸1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的大试管中水中 → 混合后从第1号试管（10-2）吸1ml →第二号试管中用此法稀释至第五号试管 → 得到10-1~10-6土壤稀释液。
（2）用划线法分离土壤中细菌
（3）用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 倒入细菌培养基成平板 → 凝固后用接种针（环）取10-4和10-5菌液一环 → 在平板上划线 → 倒置在28℃，培养2~3天观察移殖。
（3）用混菌法分离土壤中放线菌
用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 皿内一边加10%酚数滴，另一边加入0.1ml10-2~10-3土壤悬液 →倒入已冷却至55~60℃左右的放线菌培养基摇匀 → 放入冷却 → 倒置在28℃培养，3~5天观察移殖。
（4）用涂布法分离真菌
用无菌培养皿一副 → 贴上标签 → 滴入2滴链霉素 → 倒入马丁氏培养基1管摇匀冷却 → 吸0.1 ml 10-4或 10-5土壤悬液放在平板上 → 用无菌三角玻璃棒涂匀 → 倒置28℃培养3~5天，观察移殖。
[作业]
1．什么叫微生物的纯培养？
2．分离微生物的方法有哪几种？
准备：每组准备一根涂棒两个接种环，两个酒精灯、将上次包好灭菌的培养皿放好，培养基融化等。
操作步骤：每人倒3个平板（3种培养基各一个），高氏1号要加5-8滴10%苯酚，马丁氏要加滴1%链霉素。土壤稀释液制备：称取5克土样放入带玻璃珠的45ml三角瓶中，这是10-1，再从10-1取1ml放入另1支装有9ml的试管中变成10-2以此类推至10-5。用涂布法分离真菌和放线菌，取10-4或10-5的菌液0.2ml于平板中央用无菌玻璃涂棒涂匀，标注带分菌名及学号，倒置28度培养。划线法分离细菌：用无菌接种环沾取10-1的菌液一环在平板划线。
结尾：取出棉塞将试管、三角瓶洗干净，牛皮纸、线绳、玻璃珠回收。
实验三 细菌的革兰氏染色
教学目标
（1）学习并掌握革兰氏染色法的步骤和关键点
（2）了解革兰氏染色原理
（3）巩固显微镜操作技术及无菌操作技术
教 学 重 点
1、革兰氏染色法的操作步骤
2、革兰氏染色结果的判断
教 学 难 点
1、涂片的厚薄
2、脱色时间的控制
教学方法
1、多媒体课件与板书相结合；
2、在课前将教师演示操作拍摄成录像，在课上适时播放，并进行同步解说；
3、革兰氏染色的过程通过边说边写的方式呈现在黑板上；
4、通过学案引导学生进行课前预习、实验操作及课后巩固复习。
课时安排：
3课时
教学过程
1、革兰氏染色法的意义是什么？
（1）有助于鉴别细菌
（2）有助于选择用药
（3）有助于了解细菌的致病性
2、革兰氏染色法的原理？
（1）渗透学说：与肽聚糖结构有关
（2）化学学说：与细菌细胞质中核糖核酸镁盐有关
（3）等电点学说：与细菌所带电荷有关
今天，我们就来学习革兰氏染色法的具体操作。
一、目的要求
1.掌握细菌涂片标本的制备方法
2.掌握革兰氏染色法的步骤和关键点
3.识别细菌的革兰氏染色结果并画图
4.学习无菌操作技术
二、材料用具
1.显微镜
2.革兰氏染液
3.香柏油,生理盐水，自来水
4.载玻片,擦镜纸,吸水纸，接种环,酒精灯，火柴
5.金黄色葡萄球菌,大肠杆菌24小时培养物
三、实验步骤
1.涂片
（1）右手持接种环在火焰中灼烧后，取生理盐（2）左手持平板,右手持接种环在火焰中灼烧,冷却后从培养基中取少量菌体,在生理盐水上做一均匀涂膜;
2.干燥
在空气中自然干燥或在火焰上方快速通过干燥 (与热固定同步进行 ).
3.热固定
手持涂片一端,在火焰上连续通过几次 ;以载玻片在手背上试感觉不烫为宜,
4.染色
（1）在标本上加结晶紫染液 1-2滴,染色 1min,轻轻滴加水洗 ;
（2）加 1-2滴革氏碘液媒染1min,轻轻水洗；
（3）滴加 95%乙醇溶液脱色,轻轻摇动玻片至液滴无色,不要过分脱色 (约 30秒 ),立即轻轻滴加水洗 ;
（4） 滴加蕃红染液复染 1min,轻轻滴加水洗 ， 晾干或吸干。
5. 油镜镜检 ;
滴上一滴香柏油，用油镜观察。
注意标本中细菌的形态,大小,排列,和颜色,
镜检完毕擦拭油镜头
四、染色结果：
革兰氏阳性菌为： 紫色 ；
革兰氏阴性菌为： 红色 ;
金黄色葡萄球菌 (24h)染色结果：革兰氏阳性
大肠杆菌(24h)染色结果：革兰氏阴性
五、问题与讨论
1.记录并描绘革兰氏染色结果,注意形状,排列和颜色,看看与理论上是否相同;如不同,分析原因 ；
2.分析影响革兰氏染色结果的因素 ;
六、总结本次课主要内容
1.干净的载玻片,合适取菌量,菌龄,热固定,
2.每一步水洗要彻底
3.酒精脱色程度是实验成功的关键
4.禁止把染液倒入水池中,回收到废液桶中
作业：
1、绘出油镜下观察的菌体图像
2、革兰氏染色的关键是哪一步？
准备工作：
实验前先配置好草酸铵结晶紫染液，卢戈氏碘液，95%乙醇，番红复染液。
实验四 霉菌的制片及简单染色
教学目标
1、学习并掌握观察霉菌形态的基本方法；
2、初步了解霉菌的形态特征；
3、学习并掌握霉菌的制片和简单染色基本技术。
4、观察并掌握酵母菌的个体形态；
5、学习并掌握鉴别酵母菌细胞死活的方法；
教学重点
霉菌的制片和简单染色基本技术、鉴别酵母菌细胞死活
教学方法
讲授
课时安排
2课时
实验器材
1、菌种：毛霉48h马铃薯琼脂平板培养物、黑曲霉48h马铃薯琼脂平板培养物、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
2、溶液试剂：乳酸石炭酸棉蓝溶液、0.1％美蓝染色液、0.05％美蓝染色液
3、仪器及其他用品：酒精灯、镊子、载玻片、盖玻片、解剖针、显微镜、50%乙醇。
教学过程
实验原理
1、霉菌：呈菌线体形态，但霉菌的菌丝和孢子比放线菌的粗得多。霉菌的菌落形态较大，质地疏松，外观干燥，不透明，菌落与培养基间连接紧密，不易挑取，菌落正反面，边缘与中心的颜色、构造通常不一致，有霉味。菌丝的孢子较大，在低倍镜下即可清晰观察到有隔或无隔菌丝和孢子及巨大的孢子囊
2、制标本时常用乳酸石炭酸棉蓝染色液，用此染液做霉菌制片的特点是细胞不变形，具有杀菌、防腐作用，不易干燥，能保持较长时间，能防止孢子四处飞散，棉蓝具有一定的染色作用，染液的蓝色能增大反差。（如果用水封片，常因渗透作用而膨胀，水也易使菌丝、孢子和气泡混为一团，影响观察。）
酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见的细菌大几倍甚至几十倍，因此，不必染色即可用显微镜观察其形态。大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的二分裂殖；子囊菌纲中的酵母菌在一定条件下，可产生子囊孢子的方式进行有性生殖。酵母菌假菌丝的生成与培养基的种类、培养条件等因素有关。
美蓝是一种弱氧化剂，氧化态呈蓝色，还原态呈无色。用美蓝对酵母细胞进行染色时，活细胞由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能将美蓝由兰色的氧化态转变为无色的还原态型，从而细胞呈无色；而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则由于细胞内还原力较弱而不具备这种能力，从而细胞呈蓝色，据此可对酵母菌的细胞死活进行鉴别。
实验步骤
霉菌染色观察
1、直接制片观察
（1）在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液。
（2）用镊子从生长有霉菌的斜面挑取霉菌菌丝
（3）用50%的乙醇浸润，洗去脱落孢子再用蒸馏水将浸过的菌丝洗一下
（4）放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来。
（5）盖上盖玻片（勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片）。
（6）镜检：先用低倍镜。再转换高倍镜镜检并记录观察结果
2、透明胶带法：
（1）、在载玻片上滴加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液
（2）、食指与拇指黏在一段透明胶带两端，使胶带呈U形，胶面朝下
（3）、胶面轻触霉菌表面
（4）、将黏在胶面的菌体浸入载玻片上的乳酸石炭酸棉蓝染色液中，并将胶带两端固定在载玻片两端
（5）、低倍镜、高倍镜镜检
注意取菌时，镊子取菌、解剖针挑取少量菌丝时，尽量减少菌丝断裂及形态破坏。
酵母染色观察
1.美蓝染色
1）染色：在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液，无菌操作作用接种环由酿酒酵母麦芽汁斜面培养物跳去少许菌体至于染液中，混合均匀，混匀后从侧面盖上盖玻片，并吸去多余的水分和染色液（注意染色液和菌液不宜过多或过少，并应基本等量，而且要混匀）。
2）镜检：将制好的染色片置于显微镜的载物台上，放置约3min后进行镜检，先用低倍镜，后用高倍镜进行观察，根据细胞颜色区分死细胞（蓝色）和活细胞（无色），并进行记录。
3）比较：染色约30min后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。
酵母菌死亡率一般用百分数来表示，以下式来计算：
死亡率=死细胞总数÷死活细胞总数×100%
4）用0.05%美蓝染色液作为对照同时进行上述实验
注意事项
1、盖盖玻片勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片；
2、尽可能将菌丝分开，以免菌丝太厚，不易于显微镜观察；加盖玻片时勿压入气泡，以免影响观察；
3、注意无菌操作，且挑取菌丝前镊子和接种环要在酒精灯上灼烧灭菌
作业
1、绘图并说明黑曲霉和毛霉的形态特征；
2、绘图标本各种菌形态特征；
3、根据你的观察，没蓝染液浓度及作用时间与酿酒酵母死活细胞比例变化是否有关系？试分析原因。
实验五 噬菌体的分离纯化
教学目标
1. 学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法。
2. 观察噬菌斑。
教学重点
噬菌体分离
教学方法
讲授
课时安排
2课时
实验材料
1.菌种：植物常见病原细菌
2.其他：一次性培养皿、无菌注射器、过滤膜、三角瓶、培养基等
教学过程
基本原理
噬菌体特异性地感染细菌的病原，所以自然界中凡有细菌分布的地方就存在噬菌体，亦即噬菌体是伴随着宿主细菌的分布而分布的，例如粪便与阴沟污水中含有大量大肠杆菌，故也能很容易地分离到大肠杆菌噬菌体；乳牛场有较多的乳酸杆菌，也容易分离到乳酸杆菌噬菌体等，一般情况下环境中噬菌体的数量是细菌数量的10倍以上。
由于噬菌体侵入细菌细胞后进行复制而导致细胞裂解，噬菌体即从中释放出来，所以
(a)在液体培养基内可使混浊的菌悬液变为澄清，此现象可指示有噬菌体存在；也可利用这一特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基，进行培养，使噬菌体增殖、释放，从而可分离到特异的噬菌体；
(b)在有宿主细菌生长的固体琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌而形成透明的空斑，称噬菌斑（图Ⅻ-1），一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这一现象可将分离到的噬菌体进行纯化与测定噬菌体的效价。
本实验是从土壤或水中分离植物病原细菌噬菌体，刚分离出的噬菌体常不纯，如表现在噬菌斑的形态、大小不一致等，然后再作进一步纯化。
操作步骤
1. 噬菌体的分离
(1)噬菌体原液制备：称取20 g土壤于100 mL无菌PBS缓冲液中（水样直接摇床震荡培养），于30-37℃、180 rpm恒温摇床震荡过夜后；将上清液分装于5 mL无菌EP管中，4℃、10000 g离心15 min，离心后用0.22 μm无菌滤膜过滤除菌，即得沉积物噬菌体原液
(2)制备菌悬液：将植物细菌病原菌用液体培养基培养至对数生长期。
(3)噬菌体原液富集：按体积比1:2将噬菌体原液与对数生长期的宿主菌（植物病原细菌）悬液混匀后30-37℃培养12-24h。
(4)制备裂解液：将以上混合培养液2500 r/min离心15分钟，上清即为裂解液。
(5)双层平板制备：分别配制固体和半固体培养基，将融化后的固体培养基倒入无菌培养皿中（刚好铺平培养皿底部为宜）并待其冷却；将噬菌体裂解液与对数生长期的宿主菌按体积比1：1混匀后静置15 min，取1 mL混合液与冷却至40℃左右的10 mL半固体培养基充分混匀，然后倒入上一步准备的平板中，待其凝固后倒置于培养箱中30-37℃培养24-48 h培养。
(6)噬菌斑观察：从培养箱中取出双层平板，肉眼直接观察平板上是否存在空斑。
2. 噬菌体的纯化
根据所形成噬菌斑的形态、大小等特征，挑取单个噬菌斑于0.1 ml对数生长期的宿主菌混匀后倒双层平板，然后倒置培养（过程同噬菌体分离中的双层平板制备），重复3-5次，直到双层平板上所形成的噬菌斑形态大小均一时，则认为已获噬菌体纯培养物。
作业：
比较分析噬菌体和细菌分离纯化异同。
